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世界华人消化杂志. 2007-06-28; 15(18): 2004-2008
Published online 2007-06-28. doi: 10.11569/wcjd.v15.i18.2004
Published online 2007-06-28. doi: 10.11569/wcjd.v15.i18.2004
SV40T抗原胃壁细胞特异性表达载体的构建与鉴定
陈辉, 郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室; 河南省分子医学重点实验室 河南省郑州市 450052
乐晓平, 金辉, 马慧洁, 张钦宪, 郑州大学基础医学院组织胚胎学教研室 河南省郑州市 450052
侯艺芳, 郑州大学第一附属医院妇产科 河南省郑州市 450052
陈辉, 1990年武汉大学生物系本科毕业, 在读博士研究生, 副教授, 主要从事遗传病诊断与分子遗传学研究.
基金项目: 河南省重大科技攻关计划资助项目, No. 0623031400.
通讯作者: 张钦宪, 450052, 郑州市大学路40号, 郑州大学基础医学院组织胚胎学教研室. qxz53@zzu.edu.cn
电话: 0371-66658153 传真: 0371-66658153
收稿日期: 2007-01-11
修回日期: 2007-03-01
接受日期: 2007-03-23
在线出版日期: 2007-06-28
修回日期: 2007-03-01
接受日期: 2007-03-23
在线出版日期: 2007-06-28
Abstract
目的: 构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T抗原的真核表达载体并进行鉴定.
方法: 采用酚-氯仿法从昆明小鼠肝细胞中提取基因组DNA, 聚合酶链式反应(PCR)扩增H+/K+ATPase β亚基启动子, 产物命名为HK. 将PCR产物纯化回收后与pMT18-T载体相连, 并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-), 构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含SV40T基因片段的质粒pLITAg中酶切回收SV40T基因, 与pcDNA3.1(-)/HK相连, 构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV, 并测序鉴定.
结果: pcDNA3.1(-)/HKSV用XbaⅠ、BamHⅠ双酶切可得到1 kb H+/K+ATPase β亚基启动子, 2.7 kb SV40T基因与5.4 kb pcDNA3.1(-)载体3条DNA条带. 用XbaⅠ、KpnⅠ双酶切电泳, 可见到约3.7与5.4 kb的两条DNA条带; 用BamHⅠ单酶切电泳, 可见到2.7与6.4 kb的2条DNA条带; 用EcoR Ⅰ单酶切, 只见到约9.1 kb的1条DNA条带, 酶切电泳结果均与设计一致. 测序结果显示, H+/K+ATPase β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中.
结论: 构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T基因的真核表达载体, 为进一步转基因小鼠及胃癌动物模型的建立提供了稳定、可靠的分子工具.
Keywords: SV40病毒; T 抗原; 真核表达; 载体构建