研究快报
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世界华人消化杂志. 2005-10-15; 13(19): 2371-2374
Published online 2005-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i19.2371
应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因
高学松, 成军, 甄真, 郭江, 张黎颖, 陶明亮
高学松, 成军, 郭江, 张黎颖, 陶明亮, 北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
甄真, 河北医科大学第三医院感染科 河北省石家庄市 050051
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队九五科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十五科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100011, 北京市东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn.
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-03-01
修回日期: 2005-04-14
接受日期: 2005-07-05
在线出版日期: 2005-10-15
Abstract

目的: 应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因.

方法: 以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3.1(-)- DNAPTP1转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为对照; 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR), 将产物与pGEM-Teasy载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库. 文库扩增后得到60个白色克隆, 经菌落PCR分析, 得到32个200-1 000 bp插入片段. 对所得片段测序, 并进行同源性分析, 获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列.

结论: 筛选到的cDNA全长序列, 包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索.

Keywords: 乙型肝炎病毒; DNA聚合酶; 反式调节; 抑制性消减杂交