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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 张建, 邵清, 刘敏, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
程明亮, 贵阳医学院第一附属医院感染科 贵州省贵阳市 550004
李强, 男, 生于1969-09-10, 四川泸州市人, 硕士研究生, 主治医师, 主要从事肝病的基础及临床研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674, No. C39900130 ; 军队"九、五"科技攻关项目 , No. 98D063 ; 军队回国留学人员启动基金项目 , No. 98H038 ; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目 , No. 01Q138 ; 军队"十、五"科技攻关面上项目 , No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
Abstract
目的: 我们在以往的研究中, 应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因. 为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能, 应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因, 进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.
方法: 用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因, 连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基和X--半乳糖(X--gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序, 进行生物信息学分析.
结果: 成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达, 配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长, 又能在铺有X--gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个, 其中含人类免疫球蛋白轻链13个, 核小体表面蛋白10个, 铁蛋白重链2个, 人类重组免疫球蛋白λ轻链11个, 14-3-3家族蛋白1个, 脑膜炎球菌PorA蛋白1个, RNA多聚酶III 3个, 烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个, 细胞色素 P450Ⅱ 2个, SLIT2蛋白1个, DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.
结论: 成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白, 为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
Keywords: N/A