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羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究
刘妍, 成军, 王琳, 王建军, 陆荫英, 李克, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
刘妍, 女, 1973-01-15生, 辽宁省海城市人, 满族, 1995年北京医科大学毕业, 军事医学科学院免疫学专业2002级硕士学位研究生, 助理研究员. 主要从事肝炎病毒的分子生物学与病毒性肝炎的发病机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No.98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
Abstract
目的
研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用, 利用差异显示技术, 筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因, 发现新型基因, 为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响, 探索新的研究方向.
方法
利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段, 构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst, 转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示, 利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因, 通过生物信息学技术, 确定新基因的序列, 设计序列特异性引物, 利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR (RT-PCR)扩增, 克隆新基因, 并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析. 利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因.
结果
构建表达载体pcDNA3.1-MHBst, 经过序列分析和酶切鉴定正确. 转染HepG2细胞系, 利用SSH技术获得差异表达的基因片段. 经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索, 证实这是一个新型基因片段. 通过对于同源基因序列的比对, 根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列, 确定新基因的序列, 将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1, 并在GenBank中注册登录.
结论
克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1, 为今后研究MHBst的反式激活作用, 开辟了新的研究方向和可能.
Keywords: N/A