病毒性肝炎
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世界华人消化杂志. 2003-04-15; 11(4): 389-393
Published online 2003-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i4.389
噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
钟彦伟, 成军, 张忠东, 孙敏, 李强, 李克, 王琳, 李莉, 张玲霞, 陈菊梅
钟彦伟, 成军, 张忠东, 孙敏, 李强, 李克, 王琳, 李莉, 张玲霞, 陈菊梅, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
钟彦伟, 女, 1965-11-02, 吉林人, 副研究员、汉族, 硕士, 主要从事噬菌体表面展示技术及其应用的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. C39970674; No. C03011402.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2002-10-29
修回日期: 2002-11-17
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15
Abstract
目的

制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).

方法

采用噬菌体表面展示技术, 将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的 HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板, 从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程, 随机挑选出48个克隆, 利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验, 对其进行免疫学检测, 获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆, 并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.

结果

对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后, 结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比, 富集了162倍. 用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性. 其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77, P24 0.714, P26 0.728, P29 0.723, P38 0.803, P39 0.762, P43 0.747等). 对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后, 确定其中有7株交叉反应较弱(P8 0.145, P24 0.119, P26 0.17, P29 0.186, P38 0.118, P39 0.138, P43 0.178), 结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果, 最后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒, SfiI/NotI双酶切后, 将片段亚克隆到pCANTAB5E载体, 进行DNA序列测定, DNA大小为771 bp, 符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.

结论

用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.

Keywords: N/A