基础研究
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世界华人消化杂志. 2019-07-08; 27(13): 807-813
在线出版日期: 2019-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v27.i13.807
表达持续活化型ALK3抑制大鼠肝星状细胞活化
石慧, 柳长柏, 肖和杰
石慧, 海南医学院第一附属医院消化内科 海南省海口市 570000
石慧, 柳长柏, 三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室 湖北省宜昌市 443000
石慧, 柳长柏, 肖和杰, 三峡大学肝病研究所 湖北省宜昌市 443000
石慧, 主治医师, 讲师, 主要从事消化系统疾病尤其是肝病临床及基础研究.
ORCID number: 石慧 (0000-0003-3933-035X); 柳长柏 (0000-0001-7954-0736).
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 81070348.
作者贡献分布: 主要实验、数据分析及文章起草由石慧完成; 课题设计、文章修改与审阅由柳长柏与肖和杰完成.
通讯作者: 柳长柏, 教授, 443000, 湖北省宜昌市大学路8号, 三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室. 295489660@qq.com
收稿日期: 2019-03-20
修回日期: 2019-06-19
接受日期: 2019-06-25
在线出版日期: 2019-07-08

背景

肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)相关, TGF-β1在其中起着重要的作用, 而BMP7能够拮抗TGF-β1, 目前主要研究的是TGF-β/BMPs-Smad信号通路, ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体, 在肝纤维化分子研究机制中较少运用.

目的

观察大鼠HSCs中稳定表达持续活化型ALK3时Smad1磷酸化及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等表达情况, 探讨BMP-7信号转导在肝纤维化发生发展过程中拮抗TGF-β1信号及其抗肝纤维化机制.

方法

建立体外培养大鼠HSCs (HSC-T6)持续活化型ALK3的稳定表达细胞株, MTT检测细胞的增殖; RT-PCR检测col1A2等相关分子mRNA水平; Western blotting检测Samd1、E-cadherin、α-SMA、col1A2蛋白表达和Smad1磷酸化; 显微镜下观察细胞形态.

结果

稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞增殖受到抑制, Smad1磷酸化显著升高, α-SMA, col1A2表达下调, E-cadherin表达上调.

结论

BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用,抑制大鼠HSCs的活化.

关键词: 骨成形蛋白7; Smadl; 磷酸化Smadl; 肝星状细胞

核心提要: 利用BMP-7Ⅰ型受体的持续性活化突变基因真核表达载体, 建立稳定高表达持续活化型BMP-7Ⅰ型受体ALK3细胞株. 无需BMP-7刺激, 持续活化型ALK3即可激活下游信号通路, 证实BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用, 抑制大鼠肝星状细胞的活化, 从而逆转肝纤维化,解决临床上肝硬化难以逆转的问题, 挽救早期肝硬化患者.


引文著录: 石慧, 柳长柏, 肖和杰. 表达持续活化型ALK3抑制大鼠肝星状细胞活化. 世界华人消化杂志 2019; 27(13): 807-813
Stable expression of constitutively activated ALK3 suppresses rat hepatic stellate cell activation
Hui Shi, Chang-Bai Liu, He-Jie Xiao
Hui Shi, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570000, Hainan Province, China
Hui Shi, Chang-Bai Liu, Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy of Hubei Province, Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China
Hui Shi, Chang-Bai Liu, He-Jie Xiao, Institute of Liver Diseases, China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81070348.
Corresponding author: Chang-Bai Liu, Professor, Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy of Hubei Province, Three Gorges University, No. 8 University Road, Yichang 443000, Hubei Province, China. 295489660@qq.com
Received: March 20, 2019
Revised: June 19, 2019
Accepted: June 25, 2019
Published online: July 8, 2019

BACKGROUND

Hepatic fibrosis is related to activation of hepatic stellate cells (HSCs) and epithelial mesenchymal transformation (EMT), in which transforming growth factor-β1 (TGF-β1) plays a pivotal role, but bone morphogenetic protein-7 (BMP7) can antagonize TGF-β1. Currently, the TGF-β/BMPs-Smad signaling pathway is a hot topic of research in this field. ALK3 belongs to the constitutively activated type Ⅰ receptor of BMPs, and its role in the molecular mechanism of hepatic fibrosis is rarely studied.

AIM

To detect the expression of Samd1, P-Smad1, and fibrosis-related genes E-cadherin, α-SMA, and col1A2 in cultured rat HSCs (HSC-T6) to investigate how BMP-7 antagonizes TGF-β1 in the development of liver fibrosis and its anti-hepatic fibrosis mechanisms.

METHODS

After HSCs-T6 were transfected with constitutively active cDNA construct expressing ALK3, RT-PCR method was used to screen the cell line with stable ALK3 expression and detect the mRNA level of col1A2. MTT assay was used to examine the proliferation of HSC-T6 cells with high expression of ALK3. Western blot method was used to detect the expression of Smad1, P-Smad1, E-cadherin, α-SMA, and co1lA2. Optic microscopy was used to detect the morphological changes of HSC-T6 cells with high expression of ALK3.

RESULTS

Compared with control cells, ALK3 high expression restrained the growth of HSC-T6 cells, suppressed the expression of α-SMA and col1A2, promoted the expression of P-Smad1 and E-cadherin, but had no significant effect on Samd1.

CONCLUSION

BMP-7 competitively antagonizes TGF-β1 induced fibrosis by enhancing the phosphorylation of Samd1.

Key Words: Bone morphogenetic protein 7; Smad1; P-Smad1; Hepatic stellate cells


0 引言

在肝纤维化发生发展过程中由于慢性炎症刺激肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)被活化, 由静止的储脂细胞转变成肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)并合成分泌大量纤维化相关因子和胶原蛋白[1]. TGF-β1在肝纤维化病理发展过程中发挥着极其重要的作用, BMP-7是TGF-β超家族成员之一, 许多研究表明BMP-7能够拮抗TGF-β的促纤维化作用, 在肝纤维化进展过程中, BMP-7表达水平被逐渐下调[2].

ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体, 无需BMP-7与BMP-7Ⅱ受体结合, 磷酸化细胞内相关信号蛋白Smad1/5/8, 磷酸化Smad1/5/8进而结合Smad4转移至细胞核并诱导下游靶基因表达.本实验利用BMP-7Ⅰ型受体的持续性活化突变基因真核表达载体pcDNA3-HASL-ALK3(QD)转染大鼠HSCs株(HSC-T6), 建立稳定高表达持续活化型BMP-7Ⅰ型受体ALK3细胞株.无需BMP-7刺激, 持续活化型ALK3即可激活下游信号通路, 探讨持续活化型ALK3对HSC-T6的影响, 探讨活化BMP-7信号通路抗肝纤维化分子机制.

1 材料和方法
1.1 材料

大鼠HSCs、DH5α大肠杆菌为三峡大学肝病研究所保存; 真核表达载体pcDNA3 -HASL-ALK3(QD)质粒由日本东京大学宫园浩平教授惠赠; 限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、RevertAidTM M-MuLV逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司; DNA纯化试剂盒为QIAGEN公司产品; LipofectamineTM 2000和Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品; 小鼠Samd1单克隆抗体、兔抗山羊P-Smad1多克隆抗体、山羊抗兔E-cadherin多克隆抗体、兔抗山羊col1A2多克隆抗体均为 Santa Cruz Biotechnology公司产品; 小鼠α-SMA单克隆抗体为Sigma公司产品; 辣根过氧化物酶标记兔抗山羊、山羊抗兔、羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司; ECL化学发光检测试剂为GE Healthcare公司产品, MTT及培养基DMEM购自美国Sigma公司; 寡聚核苷酸引物由上海生工技术服务有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代: 本实验所用的细胞株大鼠HSCsHSC-T6置于含10%小牛血清及1%青霉素/链霉素的培养液DMEM, 37 ℃ 5% CO2培养箱中培养. 细胞传代方法: 弃去旧的培养液, 用3 mL PBS洗2次后, 每瓶500 μL1%胰蛋白酶消化细胞1 min; 用3 mL细胞完全培养液终止消化并将细胞悬液转入15 mL离心管中, 800 rpm离心3 min, 弃上清液; 细胞用培养液重悬后, 以1:3的比例传代.

1.2.2 重组质粒鉴定: 用重组质粒pcDNA3-HASL-ALK3转化E.coli DH5α感受态细胞, 用含0.1 g/L氨苄青霉素的琼脂糖培养平板进行筛选, 挑取阳性单克隆菌落扩增培养, 提取质粒并用EcoRI/XhoI进行双酶切鉴定. 酶切鉴定正确的质粒纯化后送上海生工生物工程有限公司测序. 测序结果用DNAMAN与GenBank序列比对无误.

1.2.3 建立稳定高表达持续活化型ALK3受体的HSC-T6细胞株: 大鼠HSC-T6在转染前1 d传代, 长至细胞融合约80%, 转染前1 h换为无血清无双抗的DMEM培养液孵育.应用LipofectamineTM 2000试剂法用纯化的重组质粒pcDNA3-HASL-ALK3转染HSC-T6细胞, 同时转染空载质粒pcDNA3.1作为对照. 37 ℃ 5% CO2培养箱孵育4-6 h后更换为DMEM完全培养液培养, 培养24 h后换为浓度800 μg/mL Neomycin的完全培养液进行筛选, 2-3 d更换一次培养液, 待细胞克隆形成后, 挑取单克隆细胞进行扩大培养.

1.2.4 RT-PCR法筛选稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞株: 分别收集稳定转染重组质粒pcDNA3-HASL-ALK3及空载质粒pcDNA3.1的HSC-T6细胞, 提取细胞总RNA, 经DU730紫外分光光度仪检测在260 nm处的吸光度值, A260nm/A280nm比值均介于1.8-2.0之间, RNA琼脂糖凝胶电泳28 S、18 S和5 S条带清晰可见, 表明抽提的RNA较完整, 未见明显降解.提取的总RNA经逆转录合成cDNA第一链, 并以合成的cDNA为模板进行PCR反应. col1A2上游引物: 5'-TGGTCTTACTGGGAACTTTG-3', 下游引物: 5'-CCGTTTGTCCGGGCTCACCA-3'; col3A1上游引物: 5'-GTTCTGTAATATGGAAACCGGAG-3', 下游引物: 5'-CAAGGACATCTTCAGGAAGATC-3', col4A2上游引物: 5'-CTGGACCCAAAGGACAACC-3', 下游引物: 5'-ACGGGTCCAGGGTCTCCT-3'; E-cadherin上游引物: 5'-CTCGTGGCTTTGTCAGCA-3', 下游引物: 5'-GACCCAGTCTCGTTTCTG-3', α-SMA上游引物: 5'-GTGTGAAGAGGAAGACAG-3'下游引物: 5'-TTGGCCTTAGGGTTCAGC-3', 以GAPDH为内参照, 上游引物: 5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3', 下游引物: 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3', PCR循环条件: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环后, 72 ℃ 5 min结束扩增. PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并在凝胶扫描仪下观察记录结果. 获得稳定高表达持续活化型ALK3的细胞株命名为CA-ALK3-T6, 稳定转染空载体质粒细胞株命名为Vector-T6.

1.2.5 Western blotting法检测稳定表达持续活化型ALK3对HSC-T6细胞的影响: 收集并裂解细胞提取总蛋白, 用BCA试剂盒蛋白定量后进行SDS-PAGE分离蛋白, 采用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上, 1%脱脂奶粉封闭过夜后, 分别用小鼠Samd1单克隆抗体(1:800稀释)、兔抗山羊P-Smad1多克隆抗体(1:800稀释)、山羊抗兔E-cadherin多克隆抗体(1:1000稀释)、兔抗山羊col1A2多克隆抗体(1:800稀释); 小鼠α-SMA单克隆抗体(1:1000稀释)和小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1:4000稀释)孵育2 h, TBST洗膜10 min/次3次, 再分别用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(1:4000稀释), 兔抗山羊IgG(1:8000稀释)和羊抗小鼠IgG(1:5000稀释)孵育1 h, TBST洗膜3次(10 min/次), 采用ECL增强化学发光法检测结果.

1.2.6 MTT法检测稳定表达持续活化型ALK3对HSC-T6细胞株增殖的影响: 以2×104个/ml的细胞密度, 接种于96孔板中, 100 μL/孔; 待细胞完全贴壁后, 加入MTT(200 μg/mL, 无血清DMEM培养基配制), 37 ℃继续孵育4 h, 去除培养基后每孔加入150 μL的DMSO, 室温摇床振荡充分溶解结晶, 全自动酶标仪570 nm波长测定各孔吸光度(OD)值, 并以此检测时间点为0 h. 用同样的方法测定细胞培养24、48、72 h各时间点的OD值, 以各时间点的OD值与0 h OD值的比值反映细胞增殖的速度.

统计学处理 应用SPSS 13.0进行分析, 数据以mean±SD表示, 样本均数比较采用t检验, 同一药物不同浓度组间采用单因素方差分析进行比较, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 稳定表达持续活化型ALK3受体对HSC-T6细胞形态的影响

倒置相差显微镜下, 对照组Vector-T6细胞呈单层生长, 细胞间连接疏松, 细胞伪足多呈星形, 胞质薄而透明, 核椭圆; 而CA-ALK3-T6细胞连接紧密, 细胞成多角形或蝌蚪形, 胞质饱满, 核圆大(图1).

图1
图1 倒置相差显微镜下观察细胞形态. A: Vector-T6细胞; B: CA-ALK3-T6细胞(×400).
2.2 稳定表达持续活化型ALK3受体对HSC-T6细胞生长增殖的影响

为观察稳定表达持续活化型ALK3受体后对HSC-T6细胞生长增殖的影响, 我们采用MTT法检测了稳定表达持续活化型ALK3对HSC-T6细胞增殖的影响(图2). 与0 h相比, 当培养24 h CA-ALK3-T6细胞和Vector-T6细胞增殖倍数分别为1.5和2.6倍; 当培养48 h, 对Vector-T6细胞增殖倍数为4.3倍, 而CA-ALK3-T6细胞为1.7倍(P<0.05); 随着时间的延长, CA-ALK3-T6细胞增殖速度较对照细胞要慢(P<0.05). 因此稳定表达持续活化型ALK3受体后可抑制HSC-T6细胞的活化增殖, 并且具有时间依赖性.

图2
图2 MTT法检测稳定表达持续活化型ALK3受体对HSC-T6细胞增殖的影响(mean±SD, n = 3). aP<0.05, bP<0.001, 与CA-ALK3-T6对比.
2.3 半定量RT-PCR检测稳定表达持续活化型ALK3受体HSC-T6细胞α-SMA、col1A2等基因表达水平

分别收集CA-ALK3-T6细胞和Vector-T6细胞, 提取总RNA, 经逆转录合成cDNA, 并以其作为模板进行RT-PCR反应. PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下观察记录结果(图3). 电泳结果显示, 与阴性对照组Vector-T6细胞相比, CA-ALK3-T6细胞株α-SMA、col1A2、col3A1、col4A2 mRNA表达水平明显下调, 而E-cadherin水平上调.

图3
图3 RT-PCR检测稳定表达持续活化型ALK3受体HSC-T6细胞相关基因表达. CA-ALK3-T6: 稳定表达持续活化型ALK3受体HSC-T6细胞株; Vector-T6: 转染pcDNA3.1空质粒HSC-T6细胞株. bP<0.001, 与CA-ALK3-T6比较.
2.4 Western blotting检测稳定表达持续活化型ALK3受体HSC-T6细胞BMP信号转导相关蛋白

我们进一步检测了稳定表达持续活化型ALK3受体HSC-T6细胞BMP信号转导及纤维化相关蛋白表达, 培养CA-ALK3-T6细胞和Vector-T6细胞, 分别收集细胞并提取细胞总蛋白, 进行Western blotting分析. 与阴性对照细胞株Vector-T6相比, CA-ALK3-T6细胞P-Smad1磷酸化水平明显上升、E-cadherin表达水平上调, α-SMA, col1A2蛋白表达下降, Smad1蛋白水平未见明显改变. 以β-actin作为内参照, 凝胶成像系统成像(图4).

图4
图4 Western blotting方法检测相关蛋白水平表达. CA-ALK3-T6: HSC-T6转染重组质粒pcDNA3-HSAL-ALK3稳定表达细胞; Vector-T6: HSC-T6转染空载质粒对照细胞株. bP<0.001, 与CA-ALK3-T6比较.
3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段, 是由各种致病因子引起肝脏损伤和炎症, 产生多种细胞因子刺激多种细胞发生上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT), 产生大量细胞外基质(extracellular matrix, ECM)并在肝脏沉积, 近年来, EMT参与肝纤维化被日渐提出, 但肝脏中EMT的发生机制尚不完全明确. 肝纤维化过程中发生EMT的最主要细胞为HSCs, HSCs活化增殖是肝纤维化发生发展的中心环节[3]. Yu等[4]也提出HSCs的激活是肝纤维化的一个关键事件, 被认为是EMT过程. EMT主要表现为细胞间粘附削弱, E-cadherin等上皮细胞分子标记表达下调, 间质细胞标志分子如a-SMA表达上调, 典型的细胞外基质成份如Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白分泌增加[5]. 因此如何抑制上皮间质转化是治疗肝纤维化重要策略之一.

TGF-β参与HSCs发生EMT, 直接或间接引起肝肌成纤维细胞的增加[6]. BMP-7是一分子大小35KD的分泌性同源二聚体蛋白, 属于TGF-β超家族成员之一[7]. BMP-7受体是一种跨膜丝/苏氨酸激酶受体, BMP-7首先与Ⅱ型受体结合, Ⅱ型受体的蛋白激酶被激活, 再与Ⅰ型受体结合, 形成异源二聚体, 催化Ⅰ型受体GS区的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化. Ⅰ型受体被激活后, 作用于Smad1、Smad5或Smad8的C端SSXS模体, 使其磷酸化, 再与Smad4形成复合物, 进入核内与多种转录因子相互作用发挥基因调控作用[8]. BMP-7基因表达不足也是纤维化进展的重要原因之一[9]. Zeisberg等[7]在慢性肾纤维化小鼠模型中高表达BMP-7能有效拮抗TGF-β1诱导的上皮间质转化. 研究还显示, BMP-7通过影响TGF-β1信号通路的下游蛋白-Smads蛋白来阻断其信号转导[10].

本文运用真核表达载体pcDNA3-HASL-ALK3(QD)建立稳定表达持续活化型ALK3受体的大鼠HSCs株(CA-ALK3-T6). 实验结果显示, 持续活化型ALK3高表达可使大鼠HSCs形态趋向静止化, 抑制大鼠HSCs活化增殖, 进一步观察发现, BMP7信号通路下游信号分子Smad1磷酸化增加、上皮细胞标志分子E-Cadherin表达水平上调; 同时, 间质细胞标志物α-SMA以及Ⅰ型胶原mRNA及蛋白表达水平下降, Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白的mRNA水平下降. 说明在大鼠HSCs中BMP-7信号通路的持续活化可逆转HSCs活化, 抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化和肌成纤维细胞增殖; 减少ECM的分泌, 从而改善肝纤维化. Yu等[4]研究发现, 在肝纤维化过程中, MEG3在体内和体外均有降低, MEG3过表达导致肝纤维化的抑制, 减少α-SMA和I型胶原蛋白. MEG3过表达通过EMT抑制HSC激活, 与上皮标记物增加和间充质标记物减少有关. 由此可见EMT是HSC激活致肝纤维化过程的关键环节. 王丽惠等[11]研究发现TGF-β1刺激HSC-T6后细胞形态发生变化, 伪足增多呈星形, 细胞间连接呈疏松状态, 呈现活化生物学特征. 本实验研究通过倒置显微镜观察发现, BMP-7信号通路持续活化导致大鼠HSCs的形态学失去活化形态特征而趋向静止化变化.

肝纤维化传统上被认为是一个不可逆转的过程, 但以上本研究显示了BMP-7信号转导可抑制TGF-β1信号通路的致纤维化效应, 为BMP-7成为治疗肝纤维化的关键靶点奠定基础. 有望以激活BMP-7信号转导为靶点来探索、开发抗肝纤维化药物并应用到临床.

文章亮点
实验背景

虽然随着人们生活水平的提高及乙肝疫苗接种, 我国乙型肝炎发病率逐年降低, 但是酒精性及丙型肝炎引起的肝硬化却并不少见, 研究数据显示, 感染人员就诊者不足1/3, 简直是冰山一角, 长期不管理的结果便是肝硬化甚至迅速进展至肝癌, 肝硬化是各种慢性肝病的晚期阶段, 治疗效果差, 且耗费大量资源, 慢性乙型病毒性肝炎临床治愈(珠峰)工程项目、国家"十二五"传染病重大专项等课题对于肝硬化的研究及治疗有巨大的贡献, 但目前仍未研究出并适用临床的有效逆转肝硬化方法.

实验动机

拟通过探讨肝硬化分子发生机制找到逆转的肝硬化关键靶点.

实验目标

本实验观察到通过研究BMP7及下游信号通路抑制肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)能逆转肝硬化核心细胞HSCs.

实验方法

倒置相差显微镜、MTT、半定量PCR、western-blotting.

实验结果

本文实验研究达到我们预期的结果, 印证了肝纤维化分子发生发展机制, 我们观察到持续活化的HSCs增殖受到抑制, 并且向未活化方向逆转, 探索了其中的分子机制, 磷酸化的smad1水平显著升高, α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达下调, 而E-cadherin表达上调. 本研究提示BMP7有希望成为肝纤维化的分子治疗靶点.

实验结论

本研究采用持续活化型ALK3的新方法, 进一步探索了肝纤维化分子发病机制, 观察到肝纤维化关键细胞HSCs活化有逆转, 进一步印证BMP7有望成为肝纤维化分子治疗靶点, 为将来肝纤维化的治疗提供新的契机.

展望前景

本实验采取成熟的实验方法, 提出了我们的观点, 但通过评审专家的意见确实有些忽略之处, 会吸取经验教训, 使实验更加严谨, 本研究未来研究方向是动物模型的研究, 未来研究方法的最佳方法仍主要以分子生物学研究方法为主.

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 海南省

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编辑:崔丽君 电编:刘继红

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