miR-346/DKK3信号轴在结肠癌中的细胞增殖的调控

摘要

目的

研究miR-346/DKK3信号轴在结肠癌中的调控作用和机制.

方法

RT-PCR实验检测miR-346在正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达水平, 随后检测其在结肠癌组织和对应的癌旁组织中的表达水平. MTT实验检测miR-346对结肠癌细胞增殖能力的影响. 流式细胞周期检测miR-346对结肠癌细胞周期的影响. 双荧光素酶报告基因实验验证miR-346和DKK3之间的结合关系. 利用siRNA和pcDNA-DKK3转染结肠癌细胞研究DKK3对结肠癌细胞功能的影响.

结果

miR-346在结肠癌细胞中的表达水平显著上调. 过表达miR-346后, 结肠癌细胞的增殖能力变强, G1期细胞比例降低, S期和G2/M期细胞比例增加. 双荧光素酶报告基因实验显示miR-346能够和DKK3直接结合. 转染siRNA抑制DKK3的表达后, 结肠癌细胞增殖能力变强, G1期细胞比例降低, S期和G2/M期细胞比例增加. 过表达DKK3后, 能够部分抵消miR-346对结肠癌细胞的促增殖作用.

结论

miR-346通过靶向结合并抑制DKK3进而促进结肠癌细胞的增殖.

关键词: miR-346; DKK3; 结肠癌

核心提要: 本文首次报道miR-346在结肠癌细胞中表达出现上调并且能够促进结肠癌细胞的增殖. 过表达miR-346后, 结肠癌细胞的增殖能力变强, G1期细胞比例降低, S期和G2/M期细胞比例增加. 同时, 我们还发现miR-346促进结肠癌细胞增殖是通过靶向抑制DKK3实现的. 我们的研究结果表明miR-346/DKK3信号轴在结肠癌发生发展中扮演了重要的角色, 可能成为结肠癌潜在的诊断标记物和药物治疗靶点.

Regulatory effect of miR-346/DKK3 axis on tumor cell proliferation in colon cancer

Yi Zhou, Yun-Chen Sun, Ke-Wei Gao, Liang Zhu

Yi Zhou, Yun-Chen Sun, Ke-Wei Gao, Liang Zhu, Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

Corresponding author to: Liang Zhu, Chief Physician, Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, No. 440, Chengdu North Road, Shanghai 200003, China. zhuliangcz@126.com

Received: October 10, 2018
Revised: November 2, 2018
Accepted: November 15, 2018
Published online: December 8, 2018

Abstract

AIM

To investigate the regulatory effect of the miR-346/DKK3 axis on tumor cell proliferation in colon cancer.

METHODS

The expression of miR-346 in normal colon epithelial cells and colon cancer cells as well as in colon tissues and noncancerous tissues was examined by RT-PCR. The effect of miR-346 on the proliferation of colon cancer cells was examined by MTT assay. Flow cytometry was used to detect the effect of miR-346 on the colon cancer cell cycle. The dual luciferase reporter gene assay was used to validate the binding relationship between miR-346 and DKK3. The effect of DKK3 on the function of colon cancer cells was studied by transfecting colon cancer cells with siRNA and pcDNA-DKK3.

RESULTS

The expression of miR-346 in colon cancer cells was significantly upregulated. Overexpression of miR-346 promoted the proliferation of colon cancer cells. The proportion of cells in G1 phase decreased, and the proportion of cells in S phase and G2/M phase increased. The dual luciferase reporter assay showed that miR-346 bound directly to the 3'-UTR of DKK3. Inhibition of DKK3 using siRNA promoted the proliferation of colon cancer cells, reduced the proportion of cells in G1 phase and increased the proportion of cells in S phase and G2/M phase. Further, overexpression of DKK3 partially abrogated the proliferative effect of miR-346 on colon cancer cells.

CONCLUSION

MiR-346 promotes the proliferation of colon cancer cells by inhibiting DKK3.

Key Words: miR-346; DKK3; Colon cancer

0 引言

结肠癌是世界上第三大常见的肿瘤, 结肠癌的发病率和死亡率仅次于肺癌的[1]. 近年来, 随着我国人民生活水平的提高、饮食结构的变化和人口老龄化的加剧, 我国结肠癌发病率显著上升[2,3]. 目前唯一有效的治疗方法是手术, 晚期结肠癌患者的生存也依赖于化疗. 因此, 早期诊断和治疗是亟待解决的问题.

miRNA是约22个核苷酸的非编码RNA分子, 其作为转录后调节因子调控基因表达[4]. miRNA通过完全或部分互补的碱基与mRNA结合, 导致靶mRNA的降解或翻译抑制[5]. 目前, 结肠癌肿瘤组织和细胞系中存在大量异常表达miRNA. Wang等[6]人通过与相邻癌旁组织比较, 发现miR-195在结直肠癌组织中的表达下调. Ma等[7]人研究了319种miRNA对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响, 发现miR-491能够诱导细胞凋亡并显着降低细胞活力. miRNA不仅在结肠癌的发生中起重要作用, 而且在结肠癌的发展和转移中起重要作用. Agostini等[8]证明了miR-20与结肠癌的疾病进展密切相关. 此外最近一项研究表明, 联合检测血清CEA和miR-14l有助于检测结肠癌的远处转移. 并且miR-14l表达与肿瘤预后呈负相关[9]. 以往的研究表明, miR-346在肿瘤发生发展中扮演重要的角色[10]. 例如miR-346通过靶向SRCIN1促进乳腺癌细胞的生物学功能, 并降低其对多西紫杉醇的化学敏感性[11]. MicroRNA-346还能够通过调节XPC/ERK/Snail/E-cadherin途径促进肺癌细胞的生长和转移, 抑制肺癌细胞凋亡[12]. 但是, 迄今为止很少有关于miR-346与结肠癌的相关研究, 其在结肠癌发生发展中扮演的角色尚不清楚.

在本研究中, 我们报道miR-346在结肠癌细胞中表达上调并显著促进结肠癌细胞的增殖. 并且miR-346对结肠癌细胞的促增殖作用是通过靶向抑制DKK3. 总之, 我们的研究结果表明miR-346/DKK3信号轴在结肠癌发生发展中扮演了重要的角色, 可能成为结肠癌潜在的诊断标记物和药物治疗靶点.

1 材料和方法

1.1 材料

FHC、HCT-116、HT-29和SW-480细胞购自中国科学院细胞库. 细胞均用含10%胎牛血清的DMEM进行培养, 培养箱的条件设置为37 ℃, 5%CO₂人结肠癌组织来自于生物芯片上海国家工程研究中心的生物银行. 本研究得到生物芯片上海国家工程研究中心伦理委员会批准. 术前获得知情同意书. 为了检测样品中miRNA的表达水平, 使用TIANScript RT试剂盒将2 μg总RNA反转录为cDNA, 之后进行RT-PCR. 内参为U6. 为了检测mRNA的表达, 取100 ng总RNA, 按照说明书使用PrimeScript RT Master Mix将其反转录为cDNA. 实验过程中所用引物序列如下所示: DKK3: 正向: 5'-ACACAGACACGAAGGTTGGA-3'; 反向: 5'-CGTCTCCCACAGATGTG ATA-3'; GAPDH: 正向: 5'-GGAGCG AGATCCCTCCAAAAT-3', 反向: 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'.

1.2 方法

1.2.1 细胞转染: 为了有效敲减DKK3的表达, 我们设计了两个siRNA, 分别作用于DKK3的不同区域. siRNA的核苷酸序列如下: siRNA-1: AAUGGUCUGGUACUUAUUCCGC,CGUUACCAGACCAUGAAUAAGG; 和siRNA-2: AUCCAUGUGCACCGAGAAA, CCAGAGAGGUCCCCGAUGA. miR-346的mimics购买自biotend公司. 我们在6孔板中提前预种好1.5×10⁵个细胞. 24 h后, 按照说明书将mimics或siRNA和转染试剂Lipofectamine 2000混合后, 加入细胞培养基中. 转染48-72 h后, 根据具体的实验要求, 收集细胞继续后续的RT-PCR和Westernblot实验.

1.2.2 荧光素酶报告实验和质粒构建: 首先抽提基因组DNA, 通过PCR扩增含有miR-346的假定靶点的DKK3的3'-UTR片段. 将野生型和突变型片段转染到PGL3载体中, 构建相应的双荧光素酶报告质粒. 使用293FT细胞来检测miR-346和DKK3之间的关系. 将细胞接种于24孔板中, 使用10%FBS的DMEM培养基培养, 24 h后进行转染. 根据试剂说明书, 使用FuGENE(Roche)将300 ng萤火虫荧光素酶报告载体和10 ng含有海肾荧光素酶的对照载体转入细胞. 每孔加入0.2 nmol/L miR-346 mimics或对照试剂. 转染48 h后, 使用双荧光素酶报告分析系统(Promega)连续测量萤火虫和海肾荧光素酶活性. 构建DKK3过表达质粒时, 将DKK3编码序列克隆到pcDNA中获得DKK3表达载体.

1.2.3 细胞增殖和细胞周期: HCT-116转染两天后, 以3×10³细胞/孔的密度种到96孔板中. 在24、48和72 h的时间点进行细胞计数. 细胞种板24、48和72 h后, 加入MTT溶液, 在37 ℃培养箱内孵育4 h. 然后每孔加入DMSO溶液, 使用分光光度计测量490 nm处的吸光度. 使用流式细胞仪进行细胞周期实验.

1.2.4 Western blotting: 收集细胞后, 加入适量裂解液提取蛋白. 用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量. 加入适量loading buffer, 99 ℃变性后, 储存于-20 ℃. 使用SDS-PAGE分离蛋白质, 转移至纯硝酸纤维素印迹膜上, 用相应抗体检测. 实验中使用的抗体包括: 抗DKK3(Bioworld, 1:3000)和抗GAPDH(BioWorld, 1:5000). 使用Image Quant LAS4000 Mini(GE Healthcare Life Sciences)扫描实验结果.

统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析. 两两比较应用t检验. P<0.05认为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-346在结肠癌中的表达及其在细胞增殖中的作用

我们在三对结肠癌和对应的癌旁组织中检测miR-346的表达. 结果提示与癌旁组织相比, 结肠癌组织中miR-346的表达水平更高(图1A). 之后在结肠癌细胞系中也观察到类似的现象. miR-346在HCT-116、HT-29和SW-480三种结肠癌细胞系中的表达显着高于其在正常结肠粘液上皮细胞FHC中的表达(图1B). 为了研究miR-346对结肠癌细胞增殖的作用, 我们使用miR-346 mimics转染HCT-116, 以达到过表达miR-346的效果. 我们发现miR-346过表达实验组的细胞数多于对照组(图1C). MTT实验结果表明, miR-346的过表达可显著促进结肠癌细胞增殖(图1D). 此外, 流式细胞仪结果显示, 过表达miR-346后, G1期细胞比例显着降低, S细胞比例和G2/M期细胞比例增加(图1E).

图1 miR-346在结肠癌中的表达及其在细胞增殖中的作用. A: 与癌旁组织相比, 结肠癌组织中miR-346的表达水平较高, ^bP<0.01; B: 三种结肠癌细胞系中miR-346的表达显着高于正常结肠粘液上皮细胞内的表达, ^bP<0.01; C: 转染miR-346 mimics后, miR-346过表达实验组的细胞数多于对照组, ^bP<0.01; D: 过表达miR-346可显著促进细胞增殖; E: 过表达miR-346后, G1期细胞比例显着降低, S期和G2/M期细胞比例增加, 实验重复三次, 差异有统计学意义, P<0.05, E展示了其中一次的结果.

2.2 DKK3是miR-346的靶基因

我们利用TargetScan和PicTar进行预测, 发现miR-346能够和DKK3的3'-UTR区域结合, 提示DKK3可能是miR-346的潜在靶标. 预测中DKK3和miR-346相互作用的具体序列如图2B(顶部)所示. 我们进行了荧光素酶报告实验, 构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒. 与空载体对照组相比, miR-346 mimics的转染明显抑制了野生型DKK3 3'-UTR荧光素酶活性, 而突变型DKK3 3'-UTR破坏了miR-346和DKK3之间的碱基配对, 导致实验组与对照组之间的荧光素酶活性无明显差异(图2B, 底部). 细胞转染miR-346 mimics后, DKK3在mRNA和蛋白质水平的表达显着下降(图2C).

图2 DKK3可能是miR-346的潜在靶标. A: 与癌旁组织相比, 结肠癌中DKK3的表达显着降低, ^bP<0.01; B: 预测中DKK3和miR-346相互作用的具体序列(顶部). miR-346 mimics的转染抑制了野生型DKK3 3'-UTR荧光素酶活性, 而突变型DKK3 3'-UTR阻断了这种抑制(底部), ^bP<0.01; C: RT-PCR和western blot实验结果表明细胞转染miR-346 mimics后, DKK3表达显着下降.

2.3 DKK3在结肠癌细胞增殖中的作用

为了研究DKK3在结肠癌细胞增殖中的作用, HCT-116转染了pcDNA-DKK3或siRNA以增加或降低细胞内DDK3的表达. 我们检测到转染pcDNA-DKK3后DKK3的mRNA水平显着增加(图3A). DKK3过表达实验组的细胞数少于对照组(图3B). DKK3的过表达可显着抑制细胞增殖, 使G1期细胞比例显着增加, S期和G2/M期细胞比例减少(图3C和3D). 另一方面, siRNA-1和siRNA-2均显著干扰细胞内DKK3的表达(图3E). 转染siRNA-1/siRNA-2后DKK3表达下调的实验组细胞数多于对照组(图3F). DKK3的表达降低显着促进细胞增殖, 并且导致处于G1期的细胞比例显着降低, S期和G2/M期的细胞比例增加(图3G和3H).

图3 DKK3在结肠癌细胞增殖中的作用. A: 转染pcDNA-DKK3后, DKK3的mRNA水平显着增加, ^aP<0.05; B: 种板48 h后, DKK3过表达实验组的细胞数少于对照组, ^bP<0.01; C: DKK3的过表达可显着抑制细胞增殖; D: DKK3的过表达使G1期细胞比例显着增加, S期和G2/M期细胞比例减少; E: 转染siRNA-1和siRNA-2均可显着降低DKK3的mRNA水平, ^bP<0.01; F: 种板48 h后, 转染siRNA-1/siRNA-2干扰DKK3表达的实验组的细胞数比对照组多, ^bP<0.01; G: DKK3的表达下降可显着促进细胞增殖; H: DKK3的表达下降使G1期的细胞比例显着降低, 以及S期和G2/M期细胞比例增加, 实验重复三次, 差异有统计学意义, P<0.05, H展示了其中一次的结果.

2.4 miR-346通过下调DKK3表达来调节细胞增殖

为了确认miR-346通过下调DKK3的表达来调节细胞增殖, 细胞共转染miR-346 mimics和pcDNA-DKK3. 转染miR-346 mimics后, DKK3的mRNA水平显着下降, 这表明内源性DKK3被抑制. 细胞共转染miR-346 mimics和pcDNA-DKK3后, DKK3的mRNA水平与对照组中的无统计学差异(图4A). miR-346过表达的实验组的细胞数多于对照组. 对照组与miR-346和DKK3过表达的实验组之间的细胞数没有差异(图4B). MTT实验结果显示miR-346的过表达可显着促进细胞增殖. 然而, 同时过表达DKK3会抑制了miR-346过表达对细胞增殖的促进作用(图4C). 进一步实验发现, miR-346的过表达使G1期细胞比例显着降低, S期和G2/M期细胞比例增加. 对照组与miR-346和DKK3过表达实验组之间各期细胞所占比例无显著差异(图4D).

图4 MiR-346通过下调DKK3表达来调节细胞增殖. A: 转染miR-346 mimics后, DKK3的mRNA水平显着增加, ^bP<0.01, 对照组与miR-346和DKK3过表达组之间DKK3的表达无显着差异; B: miR-346过表达的实验组的细胞数量多于对照组, ^bP<0.01, 对照组与miR-346和DKK3过表达组之间细胞数无显着差异; C: 过表达miR-346可显着促进细胞增殖. 对照组与miR-346和DKK3过表达组之间细胞增殖无显着差异; D: 过表达miR-346使G1期细胞比例显着降低, S期和G2/M期细胞比例增加. 对照组与miR-346和DKK3过表达组之间细胞周期无显着差异.

3 讨论

大量研究表明miRNA在肿瘤中的表达量发生异常, 其通过调控癌基因的激活和抑癌基因的缺失, 从而影响肿瘤细胞的增殖和生长[13-15]. 有研究发现在甲状腺癌细胞系中, 过表达miR-346会促进细胞增殖, 抑制内源性miR-346表达导致细胞生长停滞[16]. 此外, miR-346还在甲状腺肿的发展过程中发挥了重要作用[17]. Alsaleh等[18]发现miR-346通过调节IL-18参与慢性炎症过程. 另一项研究报道, 在粘膜炎症期间, TNF-α通过miR-346下调上皮维生素D受体[19]. Guo等[20]研究了miR-346在宫颈癌中的作用. 他们发现miR-346在宫颈癌中高表达, 可促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭, 并增强Argonaute2的表达. 因此, miR-346可能作为致癌基因参与肿瘤的发生和发展. 本研究发现在结肠癌和结肠癌细胞系中miR-346的表达显着增加. 然后我们在结肠癌细胞系中使用miR-346 mimics来过表达miR-346. 通过一系列实验证明, miR-346可以促进细胞增殖. 那其发挥作用的具体机制是什么？

根据TargetScan和PicTar的预测, DKK3是miR-346的潜在靶基因. DKK3属于DKK家族, 其表达的蛋白是Wnt信号通路的抑制剂[21]. Wnt信号通路参与细胞增殖、分化、炎症、癌症等多种生理病理过程等. Wnt信号通路的异常激活的情况在多种肿瘤中都有所发现[22-24]. 最近的研究发现阻断Wnt信号通路可以抑制肿瘤生长. 这表明DKK3可能是肿瘤抑制因子. DKK3在多种人类肿瘤组织和细胞系中表达减弱或消失, 包括前列腺癌、宫颈癌、胃癌、肺癌和结肠癌[25-30]. 本研究得出了类似的结果. 为了证实DKK3是miR-346的靶基因, 我们进行了双荧光素酶报告实验, 构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒. 与空载体对照组相比, miR-346 mimics的转染明显抑制了野生型DKK3 3'-UTR荧光素酶活性, 而突变型DKK3 3'-UTR破坏了miR-346和DKK3之间的碱基配对, 导致实验组与对照组之间的荧光素酶活性无明显差异. 此外, 细胞转染miR-346 mimics后, DKK3在mRNA和蛋白质水平的表达量显着下降. 这些结果表明DKK3是miR-346的靶基因.

为了研究DKK3在结肠癌细胞增殖中的作用, HCT-116转染了pcDNA-DKK3或siRNA以增加或降低细胞内DDK3的表达. 我们发现DKK3可以显着抑制细胞增殖. 最后, 过表达miR-346可以显着促进细胞增殖. 而DKK3可以抑制miR-346对细胞增殖的促进作用. 于是, 我们猜测miR-346是通过下调DKK3来影响结肠癌的细胞增殖.

总之, 本研究的结果表明miR-346是结肠癌中的致癌基因. 它通过下调DKK3来调控结肠癌的细胞增殖. 这些研究结果表明miR-346/DKK3信号轴是潜在的临床诊断和治疗方法. 然而, 本研究仍存在一些不足之处. 首先, 未进行miR-346对结肠癌细胞的细胞凋亡、侵袭和其他生物学行为影响的实验. 其次, 未进行动物实验进一步验证miR-346在结肠癌中的生物学功能. 这些将在今后的研究中进一步改善.

文章亮点

实验背景

非编码RNA和结肠癌之间的关系一直是医学研究的重点和热点. miR-346被发现参与了多种肿瘤的进展. 但目前尚缺少miR-346与结肠癌的相关研究. 本文拟通过细胞功能实验探究miR-346在结肠癌中的作用及机制.

实验动机

本课题围绕着miR-346在结肠癌细胞中的功能作用进行研究, 揭示miR-346对结肠癌细胞的调控作用.

实验目标

本论文通过研究miR-346对结肠癌细胞增殖功能的调控作用, 及寻找下游的靶基因, 揭示了miR-346在结肠癌发生发展中的作用机制.

实验方法

本文采用了MTT实验研究miR-346对结肠癌细胞功能的影响, 利用流式细胞仪分析miR-346对结肠癌细胞周期的影响, 通过报告基因实验寻找miR-346下游的靶基因, 并验证两者之间的调控作用.

实验结果

本研究达到实验目标. 发现miR-346能够通过抑制下游靶基因DKK3调控结肠癌细胞的增殖能力. 进一步丰富了非编码RNA与结肠癌之间的调控网络.

实验结论

本研究发现miR-346能够促进结肠癌细胞增殖, 以及发现了mIR-346新的靶基因DKK3. 本研究提出miR-346通过抑制DKK3促进结肠癌细胞的增殖. 通过干预miR-346-DKK3轴调控结肠癌细胞的功能. miR-346通过抑制DKK3促进结肠癌细胞的增殖. miR-346促进结肠癌细胞增殖, G1期细胞比例显着降低, S期和G2/M期细胞比例增加. 为今后潜在的临床应用提供理论基础.

展望前景

miR-346下游有许多靶基因, DKK3只是其中的一个. 寻找下游靶基因需要报告基因、WB等多个实验进行验证. 进一步研究miR-346对结肠癌细胞迁移、侵袭、凋亡的作用.

备注

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 上海市

同行评议报告分类

A级 (优秀): 0

B级 (非常好): B, B

C级 (良好): C

D级 (一般): D, D

E级 (差): 0

编辑:崔丽君 电编:张砚梁

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