hMLH1、hMSH2、hMSH6、Integrin β1和Ki-67在结直肠癌组织表达对预后的影响分析

摘要

目的

探究分析错配修复基因(mismatch repair gene, MMR)蛋白中的hMLH1、hMSH2、hMSH6以及整合素β1(Integrin β1)和Ki-67在结直肠癌组织表达水平以及对预后的影响.

方法

收集来我院治疗的结直肠癌患者的肿瘤标本162例, 采用免疫组织化学染色法测定标本中hMLH1、hMSH2、hMSH6、Integrin β1和Ki-67的表达水平, 分析其影响因素, 进行统计学分析比较.

结果

(1)162例标本中有36例标本存在hMLH1、hMSH2、hMSH6的表达缺失, 缺失率为22.22%; (2)MMR蛋白表达缺失在肿瘤直径(P = 0.0005)、Dukes分期(P = 0.0248)、肿瘤家族史(P = 0.0042)和淋巴结转移(P = 0.0014)等方面差异具有统计学意义(P<0.05); (3)Integrin β1阳性表达水平在Dukes分期(P = 0.0002)方面差异存在统计学意义(P<0.05), Ki-67的阳性表达水平在Dukes分期(P = 0.0002)、淋巴结转移(P = 0.0111)等方面差异具有统计学意义(P<0.05); (4)MMR蛋白表达缺失、Integrinβ1阳性表达和Ki-67的阳性表达与Dukes分期(P = 0.006)、淋巴结转移(P = 0.023)有关, 差异具有统计学意义(P<0.05); (5)dMMR组患者5年的生存率为88.89%, pMMR组患者5年的生存率为59.52%, 差异具有统计学意义(P = 0.0010); Integrin β1阳性表达组患者5年生存率为59.69%, 阴性表达组患者5年生存率为90.91%, 差异具有统计学意义(P = 0.0007); Ki-67的阳性表达组患者5年生存率为63.27%, 阴性表达组患者5年生存率为93.33%, 差异具有统计学意义(P = 0.0192).

结论

患者的MMR蛋白、Integrin β1和Ki-67的表达水平与患者肿瘤的Dukes分期及淋巴结是否转移具有统计学意义上的相关性, 且这三种因素均与患者的预后有关. 其中, MMR蛋白表达缺失, Integrin β1和Ki-67的阴性表达的患者预后情况较好, 患者的5年生存率较高.

关键词: 错配修复基因蛋白表达; Integrin β1; Ki-67; Dukes分期; 淋巴结转移

核心提要: 结直肠癌的发生与错配修复基因蛋白中的hMLH1、hMSH2、hMSH6有密切关系, Integrin β1与肿瘤的转移有相关联系, Ki-67可反映肿瘤细胞的分化程度及转移状态. 本研究综合探讨以上因素的表达结直肠癌患者对预后的影响.

Effect of hMLH1, hMSH2, hMSH6, integrin β1, and Ki-67 expression on prognosis of colorectal cancer

Hao-Liang Ni, Yue-Jun Han, Xi-Han Jin

Hao-Liang Ni, Yue-Jun Han, Xi-Han Jin, Department of Anorectal Surgery, Jinhua Hospital of Jinhua University, Jinhua 321000, Zhejiang Province, China

Corresponding author to: Hao-Liang Ni, Attending Physician, Department of Anorectal Surgery, Jinhua Hospital of Jinhua University, 351 Mingyue Street, Wucheng District, Jinhua 321000, Zhejiang Province, China. wuzo2295@163.com

Received: August 27, 2018
Revised: September 21, 2018
Accepted: October 8, 2018
Published online: November 18, 2018

Abstract

AIM

To investigate the expression of hMLH1, hMSH2, hMSH6, integrin β1, and Ki-67 in colorectal cancer and to analyze their effect on the prognosis of this malignancy.

METHODS

One hundred and sixty-two tumor specimens of colorectal cancer patients treated in Jinhua Hospital of Jinhua University were collected, and immunohistochemical staining was used to determine the expression of hMLH1, hMSH2, hMSH6, integrin β1, and Ki-67 in the specimens. The results were analyzed statistically.

RESULTS

Among 162 specimens, 36 were found to have missing expression of hMLH1, hMSH2, and hMSH6, with a deletion rate of 22.22%. The expression of MMR protein was significantly associated with tumor diameter (P = 0.0005), Dukes stage (P = 0.0248), family history of tumor (P = 0.0042), and lymph node metastasis (P = 0.0014). The positive expression of integrin β1 was significantly associated with Dukes stage (P = 0.0002), and the positive expression of Ki-67 was significantly associated with Dukes stage (P = 0.0002) and lymph node metastasis (P = 0.0111). Loss of MMR protein expression and positive expression of integrin β1 and Ki-67 were significantly associated with Dukes stage (P = 0.006) and lymph node metastasis (P = 0.023). The 5-year survival rate was 88.89% in the deficient mismatch repair group and 59.52% in the proficient mismatch repair group, and the difference was statistically significant (P = 0.0010). The 5-year survival rate was significantly lower in the integrin β1 positive group than in the integrin β1 negative group (59.69% vs 90.91%, P = 0.0007). The 5-year survival rate was also significantly lower in the Ki-67 positive group than in the Ki-67 negative group (63.27% vs 93.33%, P = 0.0192).

CONCLUSION

The expression of MMR protein, integrin β1, and Ki-67 is statistically correlated with Dukes stage and lymph node metastasis in colorectal cancer, and all the three factors are related to the prognosis of patients: loss of MMR protein expression and negative expression of integrin β1 and Ki-67 are associated with better prognosis and higher 5-year survival rate.

Key Words: Mismatch repair protein expression; Integrin β1; Ki-67; Dukes staging; Lymph node metastasis

0 引言

结直肠癌是临床上常见的一种发病率和死亡率都非常高的疾病[1,2], 对于该病的研究一直是研究人员关注的热点. 研究表明, 错配修复基因(mismatch repair protein, MMR) 蛋白与结直肠癌的发生有密切关系[3], 其中, hMLH1、hMSH2、hMSH6起到主要作用[4]. 整合素(Integrins)是一种细胞黏附分子, 它能够影响细胞的迁移, 与肿瘤的转移具有相关联系[5,6], Ki-67是一种核蛋白质, 与细胞增殖有密切关系, 因此可以用来反映肿瘤细胞的分化程度及转移状态[7]. 临床上对于以上因素均有所研究, 但是并未将其进行综合考量, 本研究综合探究hMLH1、hMSH2、hMSH6、Integrin β1和Ki-67在结直肠癌组织表达对预后的影响, 以期对临床研究有所参考. 现将报道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

选取我院近年来收治的结直肠癌患者肿瘤标本共计162例, 其中男性85例, 女性77例, 年龄40-68岁, 平均年龄54.1岁±5.3岁. 患者纳入标准: (1)患者经临床确诊为结直肠癌, 且患者病历资料完整; (2)患者入院前均未进行治疗; (3)患者均采用相同的治疗方式; (4)化疗方案均应用FOLFOX; (5)患者及其家属均知情并同意, 且签订知情书. 排除标准: (1)患者病历资料不完整者; (2)患者入院前进行过治疗; (3)患者患有其他疾病, 对本研究有影响者; (4)未签署知情书者. 两组患者在性别、年龄等方面差异无统计学意义(P>0.05).

1.2 方法

采用免疫组织化学法测定上述基因蛋白的表达情况, 具体如下: (1)标本采用10%甲醛固定, 常规脱水及石蜡包埋, 以5 μm厚度连续切片; (2)常规HE染色, 用PV-9000二步法进行免疫组织化学法染色; (3)对于MMR蛋白, 一抗为hMLH1、hMSH2、hMSH6鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司), 用正常的结直肠黏膜上皮作阳性对照, 以磷酸盐缓冲液替代一抗作阴性对照; (4)对于Integrin β1, 一抗为鼠抗人Integrin β1单克隆抗体(Santa Cruz 公司), 磷酸盐缓冲液PBS替代一抗作为阴性对照; (5)对于Ki-67, 鼠抗人Ki-67单克隆抗体(德泰生物科技有限公司), 以磷酸盐缓冲液替代一抗作阴性对照; (6)采用苏木素进行染色, 脱水后用透明树胶封片.

1.3 结果评定标准

1.3.1 MMR蛋白评定标准: 判断标准参考《免疫组织化学反应结果的判断标准》[8]中, 以细胞核出现黄褐色或棕黄色颗粒为hMLH1、hMSH2、hMSH6阳性细胞. (1)按染色程度进行评分: 无色为0分, 黄色为1分, 棕黄色为2分, 棕褐色为3分. (2)按阳性细胞所占的比例进行评分: 阴性为0分, 阳性细胞≤10%为1分, 11%-50%为2分, 51%-75%为3分, ＞75%为4分. 其蛋白两项评分的乘积＞3分判定为该蛋白表达正常, 否则判定为表达缺失.

将hMLH1、hMSH2、hMSH6中至少一项蛋白表达缺失判定为MMR蛋白表达缺失deficient mismatch repair, dMMR), 全部蛋白表达正常定为MMR蛋白表达正常(proficient mismatch repair, pMMR).

1.3.2 Integrin β1评定标准: Integrin β1以细胞膜或胞质着棕黄色颗粒为阳性. 采用半定量方法评定染色结果[9], 根据阳性细胞的数量和染色强度进行计分: (1)染色强度的记分标准, 不着色记0分、轻度着色(略强于阴性对照, 表现为淡黄色颗粒)记1分、中度着色记2分、重度着色记3分; (2)阳性细胞数量的记分标准, <10%的细胞着色记1分、10%-50%的细胞着色记2分、>50%的细胞着色记3分.

1.3.3 Ki-67评定标准: 染色阳性细胞的细胞核呈棕黄色至深棕色. 统计1000个肿瘤细胞, 计算阳性细胞所占百分比(即阳性表达率), 若阳性表达率低于10%, 则呈现无明显阳性反应; 若阳性表达率大于或等于10%, 则为阳性反应.

1.3.4 术后随访: 对患者治疗后进行为期5年的随访, 出院后每3 mo随访一次, 两年后每6 mo随访一次. 随访方式以电话随访为主, 辅以门诊随访. 患者的总生存期以出院当天开始, 直至随访结束或者患者去世.

统计学处理 采用SPSS 20软件进行统计学处理, 肿瘤部位、肿瘤直径等临床病理特征资料采用χ²检验, 多因素分析采用Logsitic回归分析. 当P<0.05时, 差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 MRR蛋白的表达情况以及其与患者临床病理特征关系

在162例标本中, 有36例MMR蛋白表达缺失(dMMR组), 缺失率为22.22%. 分析dMMR组和pMMR组与患者临床病理特征之间的关系: 两组患者在肿瘤直径(P = 0.0005)、Dukes分期(P = 0.0248)、肿瘤家族史(P = 0.0042)和淋巴结转移(P = 0.0014)等方面差异具有统计学意义(P<0.05)(表1和图1).

表1 dMMR组和pMMR组患者临床病理特征比较表.

	n	dMMR组	pMMR组	χ2	P值
年龄
≥60岁	87	22	65	1.0215	0.3122
＜60岁	75	14	61
肿瘤位置
右半结肠	97	21	76	0.0459	0.8304
直肠+左半结肠	65	15	50
肿瘤直径
≥5 cm	67	24	43	12.2241	0.0005
<5 cm	95	12	83
肿瘤类型
腺癌	118	27	91	0.1092	0.7410
其他	44	9	35
Dukes分期
A	16	8	8	9.3643	0.0248
B	68	16	52
C	43	7	36
D	35	5	30
肿瘤家族史
直结肠癌肿瘤史	14	7	7	10.9586	0.0042
其他肿瘤史	26	9	17
无	122	20	102
淋巴结转移
有	83	10	73	10.1932	0.0014
无	79	26	53

dMMR: MMR蛋白表达缺失; pMMR: MMR蛋白表达正常.

图1 MMR蛋白免疫组织化学图. A: hMLH1蛋白; B: hMLH2蛋白; C: hMLH6蛋白.

2.2 Integrin β1和Ki-67表达与患者临床病理特征关系

Integrin β1阳性表达水平在Dukes分期(P = 0.0002)方面差异存在统计学意义(P<0.05), Ki-67的阳性表达水平在Dukes分期(P = 0.0002)、淋巴结转移(P = 0.0111)等方面差异具有统计学意义(P<0.05)(表2和图2).

表2 Integrin β1和Ki-67表达与患者临床病理特征比较表.

	n	Integrin β1阳性表达	χ2	P值	Ki-67阳性表达	χ2	P值
年龄
≥60岁	87	69	0.0118	0.9135	79	0.0009	0.9759
＜60岁	75	60			68
肿瘤位置
右半结肠	97	77	0.0092	0.9237	87	0.3172	0.5733
直肠+左半结肠	65	52			60
肿瘤直径
≥5 cm	67	54	0.0088	0.9251	61	0.0126	0.9107
<5 cm	95	75			86
肿瘤类型
腺癌	118	94	0.0003	0.9870	107	0.0020	0.9640
其他	44	35			40
Dukes分期
A	16	9	19.4143	0.0002	8	19.4662	0.0002
B	68	47			63
C	43	40			42
D	35	33			34
肿瘤家族史
直结肠癌肿瘤史	14	11	0.0316	0.9843	13	0.1989	0.9053

dMMR: MMR蛋白表达缺失; pMMR: MMR蛋白表达正常.

图2 Integrinβ1和Ki-67蛋白表达情况图. A: Integrin β1蛋白表达情况; B: Ki-67表达情况.

2.3 MRR蛋白、Integrinβ1和Ki-67表达与患者临床病理特征多因素分析

通过Logistic回归分析, MMR蛋白表达缺失、Integrin β1阳性表达和Ki-67的阳性表达与Dukes分期(P = 0.006)、淋巴结转移(P = 0.023)有关, 差异具有统计学意义(P<0.05). 详见表3.

表3 MRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达与患者临床病理特征多因素分析表.

特征变量	b值	SE	Waldχ2值	OR(95%CI)	P值
肿瘤直径	0.265	0.249	1.217	1.297(0.821-2.158)	0.294
肿瘤家族史	1.562	0.326	6.427	0.612(0.651-0.742)	0.086
Dukes分期	1.523	0.517	7.261	0.327(0.094-0.658)	0.006
淋巴结转移	0.852	0.394	5.237	2.326(1.212-4.685)	0.023

2.4 MRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达与术后5年患者生存率分析

对患者进行术后随访, dMMR组患者5年的生存率为88.89%, pMMR组患者5年的生存率为59.52%, 差异具有统计学意义(P = 0.0010); Integrin β1阳性表达组患者5年生存率为59.69%, 阴性表达组患者5年生存率为90.91%, 差异具有统计学意义(P = 0.0007); Ki-67的阳性表达组患者5年生存率为63.27%, 阴性表达组患者5年生存率为93.33%, 差异具有统计学意义(P = 0.0192). 详见表4.

表4 MRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达与术后5年患者生存率比较表.

	MMR		Integrin β1		Ki-67
	dMMR组	pMMR组	阳性表达	阴性表达	阳性表达	阴性表达
生存率	88.89%(32/36)	59.52%(75/126)	59.69%(77/129)	90.91%(30/33)	63.27%(93/147)	93.33%(14/15)
χ2	10.7672		11.4213		5.4877
P值	0.0010		0.0007		0.0192

dMMR: MMR蛋白表达缺失; pMMR: MMR蛋白表达正常.

3 讨论

结直肠癌的发病率和病死率正在呈现逐年上升的趋势[10], 对结直肠癌进行研究十分必要. 很多研究表明, MMR蛋白在结直肠癌患者中具有重要的作用[11-13]. MMR基因的功能在于校正基因复制时出错的碱基, 从而保持基因复制的准确性, 避免基因发生突变; 当细胞发生变异时, 又可以介导其凋亡, 避免肿瘤的发生[14]. 在本研究中, dMMR组和pMMR组在肿瘤直径、Dukes分期、肿瘤家族史和淋巴结转移等方面存在差异, 同时, dMMR组的生存率要高于pMMR组. 分析其原因: (1)dMMR组患者的肿瘤直径要大于pMMR组, 这样其肿瘤便于切除, 且不易转移(dMMR组患者淋巴转移率低于pMMR组也证实此点); (2)dMMR组患者基本上在Dukes分期的B阶段, 属于中前期肿瘤, 便于治疗. 因此预后较好.

细胞的黏附反应是肿瘤淋巴转移的关键环节, 而淋巴转移是术后复发及影响患者生存的一个重要因素[15]. Integrin β1是整合素中最大亚群, 整合素是重要的细胞黏附分子, 它对于肿瘤转移具有重大意义. 在本研究中, Integrin β1表达水平在Dukes分期具有差异, 这与罗冲等[16]人研究一致. 分析其原因, Dukes分期的重要标志就是肿瘤的发展程度, 因此Integrin β1表达水平在Dukes分期具有差异. Ki-67是一种能提示细胞增殖活跃程度的核蛋白质, 可作为细胞增殖的标记物[17]. 在本研究中, Ki-67表达水平在Dukes分期、淋巴结转移方面具有差异, 这与钟华等[18]人研究一致. 通过Logistic回归分析, MMR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达与Dukes分期、淋巴结转移有关系. 究其原因, Dukes分期和淋巴结转移, 肿瘤细胞处于一个活跃状态, 细胞的分化、增殖与以上因素的表达有紧密联系.

在本研究中, dMMR组、Integrin β1和Ki-67阴性表达的患者5年生存率比较高, 患者的预后较好. 分析原因: (1)dMMR组患者大部分处于Dukes分期B期、高分化、肿瘤直径>5 cm的患者, 更难发生淋巴结转移; (2)Integrin β1阴性表达, 表明细胞黏附分子水平处于正常水准, 肿瘤细胞不具有强大侵袭迁移能力; (3)Ki-67阴性表达, 表明细胞活动水平低, 进而肿瘤细胞的分裂分化活跃程度低. 肿瘤的产生是一个复杂的过程, 与很多因素有关, 由于肿瘤发展的复杂性, 可能有一些因素本研究中未能考虑到. 在本研究中, dMMR组、Integrinβ1和Ki-67的表达与结直肠癌患者的临床病理特征以及预后都具有相关性.

总之, 结直肠癌患者的MMR蛋白、Integrin β1和Ki-67的表达水平与患者肿瘤的Dukes分期及淋巴结是否转移具有统计学意义上的相关性, 此外, MMR蛋白表达缺失, Integrin β1和Ki-67的阴性表达的患者预后情况较好, 患者的5年生存率较高.

文章亮点

实验背景

结直肠癌是临床上常见的一种发病率和死亡率都非常高的疾病, 研究表明, 错配修复基因蛋白(mismatch repair protein, MMR), 特别是其中的hMLH1、hMSH2、hMSH6分子, 与结直肠癌的发生有密切关系. 整合素(Integrins)是一种细胞黏附分子, 它能够影响细胞的迁移, 与肿瘤的转移具有相关联系, Ki-67是一种核蛋白质, 与细胞增殖有密切关系, 因此可以用来反映肿瘤细胞的分化程度及转移状态. 临床上对于以上因素均有所研究, 但是并未将其进行综合考量, 因此综合探究上述因素的表达对患者预后的影响具有重要的临床价值.

实验动机

本研究采用前瞻性对照研究方式, 来对比癌症组织与正常组织之间的hMLH1、hMSH2、hMSH6、Integrin β1和Ki-67的表达水平, 旨在为临床治疗提供客观参考和治疗依据.

实验目标

本研究采用前瞻性对照研究方式, 探讨癌症组织与正常组织之间的hMLH1、hMSH2、hMSH6、Integrin β1和Ki-67的表达水平的高低, 观察两种组织之间水平变化趋势并分析其原因, 旨在综合探究相关因素的表达变化在癌症组织中的影响, 并分析其与患者预后关系.

实验方法

收集患者癌症组织标本, 采用免疫组织化学法测定hMLH1、hMSH2、hMSH6、Integrin β1和Ki-67的表达情况, 参考《免疫组织化学反应结果的判断标准》对测定结果进行判断, 并将其与正常组织标本进行对比验证. 此外, 对癌症标本提供患者进行术后随访, 以判断患者预后情况.

实验结果

本研究的实验目标基本达到, MRR蛋白的表达缺失与患者的肿瘤直径、Dukes分期、肿瘤家族史和淋巴结转移等指标具有相关性, 统计结果具有统计学意义(P<0.05). Integrin β1和Ki-67表达与患者的Dukes分期、淋巴结转移具有相关性, 统计结果具有统计学意义(P<0.05). 多因素分析表明, Dukes分期、淋巴结转移与患者相关因素表达具有相关性意义, 统计结果具有统计学意义(P<0.05). 术后随访结果表明, 患者生存率与MRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达水平有关.

实验结论

本研究分析对比了不同组织中, MRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达水平与患者相关病理特征之间的关系, 并通过对患者术后随访调查, 证实了这几种因素与患者预后情况具有很大关系. 降低pMRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达水平, 能够提高患者预后, 这给临床上的研究提供参考.

展望前景

本研究探究了MRR蛋白、Integrin β1和Ki-67表达水平与结直肠癌患者预后之间的关系, 得出了MMR蛋白表达缺失, Integrin β1和Ki-67的阴性表达对患者预后有利的结论. 但是, 本研究也存在不足之处, 例如对于这几种因素之间的相关关系未做进一步研究, 研究方案还需进一步完善.

备注

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

同行评议报告分类

A级 (优秀): 0

B级 (非常好): B

C级 (良好): C, C

D级 (一般): D

E级 (差): 0

编辑:崔丽君 电编:张砚梁

参考文献

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