临床研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2018. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2018-06-28; 26(18): 1111-1118
在线出版日期: 2018-06-28. doi: 10.11569/wcjd.v26.i18.1111
幽门螺杆菌耐药性及三种耐药检测方法的比较
孙婷, 陈泽鑫, 李鹏, 何向蕾
孙婷, 何向蕾, 浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院病理科 浙江省杭州市 310014
孙婷, 技师, 主要研究癌症信号通路和微生物耐药机制.
陈泽鑫, 浙江大学附属第二医院科教科 浙江省杭州市 310009
李鹏, 浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院消化内科 浙江省杭州市 310014
ORCID number: 孙婷 (0000-0001-6235-2923).
基金项目: 浙江省自然科学基金项目资助, No. LY17H160065.
作者贡献分布: 此课题由孙婷设计和完善; 临床标本和实验试剂由何向蕾提供; 研究过程由孙婷操作完成; 文章润色和部分修改由李鹏完成; 数据分析由陈泽鑫完成.
通讯作者: 何向蕾, 主任医师, 兼职教授, 310014, 浙江省杭州市下城区上塘路158号, 浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院病理科. hexianglei@hmc.edu.cn
电话: 0571-85893289
收稿日期: 2018-03-22
修回日期: 2018-05-10
接受日期: 2018-05-16
在线出版日期: 2018-06-28

目的

分析浙江地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)耐药情况, 并比较不同耐药检测方法的一致性.

方法

选择2017-06/2017-09进行胃镜检查的305例患者, 取胃黏膜组织进行H. pylori菌株分离鉴定, 对分离的127个菌株进行6种抗生素的药敏实验, 提取菌株的DNA, 以荧光定量PCR法和测序法对克拉霉素耐药相关基因23S rRNA和左氧氟沙星耐药相关基因gyrA进行扩增和测序.

结果

在305 份胃黏膜活检标本中, 分离出H. pylori127 株. 127株H. pylori中124株为耐药菌株, 3 株为敏感菌株. 阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮无耐药菌株; 克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑耐药率分别为33.86%(43/127)、44.88%(57/127)、91.34%(116/127)、三重耐药率为18.90%(24/127); 克拉霉素和左氧氟沙星相关的主要耐药基因及其突变位点分别为23S rRNA(A2143G)、gyrA(C261A/G), 突变频率分别为 42.5%(54/127)和15.0%(19/127). 不同耐药检测方法的一致性比较: 荧光定量PCR法与测序法检测耐药突变一致性较高, 与药敏培养法一致性相对较差.

结论

浙江地区对克拉霉素、左氧氟沙星耐药率均达到很高, 在临床应用这些抗生素需结合耐药性, 选择敏感的抗生素个体化地用药, 提高根除效率.

关键词: 幽门螺杆菌; 耐药性; 耐药基因

核心提要: 现有的经验性抗生素用药治疗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)已经不能满足临床根治的需求, 就浙江地区来说, H. pylori对克拉霉素、左氧氟沙星的单药耐药率和双重耐药率均较高, 临床需要推行H. pylori耐药性检测, 首选荧光定量PCR法, 选择敏感的抗生素个体化地用药, 提高根除效率.


引文著录: 孙婷, 陈泽鑫, 李鹏, 何向蕾. 幽门螺杆菌耐药性及三种耐药检测方法的比较. 世界华人消化杂志 2018; 26(18): 1111-1118
Drug resistance of Helicobacter pylori in Zhejiang: Comparison of three methods for detection of drug resistance
Ting Sun, Ze-Xin Chen, Peng Li, Xiang-Lei He
Ting Sun, Xiang-Lei He, Department of Pathology, Zhejiang Provincial People's Hospital, People′s Hospital of Hangzhou Medical College, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China
Ze-Xin Chen, Department of Science and Education, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, Zhejiang Province, China
Peng Li, Department of Gastroenterology, Zhejiang Provincial People's Hospital, People′s Hospital of Hangzhou Medical College, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China
Supported by: Zhejiang Provincial Natural Science Foundation, No. LY17H160065.
Correspondence to: Xiang-Lei He, Chief Physician, Associate Professor, Department of Pathology, Zhejiang Provincial People's Hospital, People′s Hospital of Hangzhou Medical College, 158 Shangtang Road, Xiacheng District, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China. hexianglei@hmc.edu.cn
Received: March 22, 2018
Revised: May 10, 2018
Accepted: May 16, 2018
Published online: June 28, 2018

AIM

To investigate the antibiotic resistance of Helicobacter pylori (H. pylori) in Zhejiang, and to compare the consistency of different methods for antibiotic resistance detection.

METHODS

From June 2017 to September 2017, 127 H. pylori strains were isolated from gastric mucosa tissues of 305 patients who underwent gastroscopy. The sensitivity of these strains to six kinds of antibiotics was determined by the agar dilution method. The related gene mutations in 23S rRNA and gyrA were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT- PCR) and gene sequencing.

RESULTS

Of the 127 H. pylori strains isolated, 124 were resistant strains and three were sensitive strains. There was no strain that was resistant to amoxicillin, tetracycline, and furazolidone. The resistance rates to clarithromycin, levofloxacin, or metronidazole were 33.86% (43/127), 44.88% (57/127), and 91.34% (116/127), respectively, and the resistance rates to the triple antibiotics was 33.86% (43/127). The main gene mutations associated with antibiotic resistance were 23S rRNA (A2143G) and gyrA (C261A/G), with mutation frequencies of 42.5% (54/127) and 15% (19/127), respectively. The drug resistance detected by RT-PCR method was consistent with that by sequencing method, but had low consistency with traditional culture method.

CONCLUSION

The antibiotic resistance rates of H. pylori to clarithromycin and levofloxacin in Zhejiang Province are remarkably high. In clinical treatment, it is necessary to test antibiotic resistance to choose proper antibiotics individually to improve the eradication efficiency.

Key Words: Helicobacter pylori; Antibiotic resistance; Gene mutations


0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是胃部感染最常见的病原体, 其可在人类胃黏膜上皮细胞和黏液层的长期定植, 几乎所有的H. pylori感染者都存在慢性活动性胃炎(chronic active gastritis, 亦即H. pylori胃炎), 15%-20% H. pylori感染者发生消化性溃疡, 包括十二指肠溃疡和胃溃疡, 5%-10% H. pylori感染者发生H. pylori相关消化不良[1,2], 约1% H. pylori感染者会发生胃恶性肿瘤(胃癌、MALT淋巴瘤). 根除H. pylori能降低消化性溃疡并发症发生率, 还可使约80%的早期胃MALT淋巴瘤获得缓解[3]. 目前根除H. pylori的一线治疗方案首选含质子泵抑制剂(proton pump inhibitor, PPI)、铋剂及2种抗菌药物的铋剂四联方案[4]. 然而, 现阶段根除H. pylori临床均实行经验性用药, H. pylori的药物敏感性检测没有在临床工作中广泛开展, 容易造成H. pylori的耐药和根除失败, 首次根除失败后再次的根除治疗无疑延长了病人服用抗生素的时间, 不仅不利于经济效益, 且长期服用抗生素容易引起胃肠道、肝肾等器官的副作用, 影响肠道微生物的稳态[5], 不利于自身免疫系统的稳定. H. pylori耐药性和基因型在不同地区、不同个体之间存在差异性[6,7], 了解本地区H. pylori的耐药情况, 推进H. pylori耐药检测方法的改进和实施, 对于提高本地区H. pylori初次治疗根除率, 有的放矢, 精准地进行个体化治疗, 具有重要意义.

1 材料和方法
1.1 材料

选取2017-06/2017-09在浙江省人民医院接受胃镜检查患者, 按照如下要求选择入组. 纳入标准: (1)年龄18-70岁, 男女不限; (2)有消化道症状, 如腹痛、腹胀、反酸、嗳气、恶心等; (3)胃镜下诊断为胃、十二指肠消化性溃疡、慢性胃炎伴糜烂患者; (4)近4 wk内未使用抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂或PPI; (5)同意取胃黏膜活检组织标本进行H. pylori培养及药敏试验并签署知情同意书. 排除标准: (1)消化道急症, 如胃穿孔、消化性溃疡大出血、呕血、急性胰腺炎等; (2)已接受H. pylori根除治疗者; (3)近1 mo内曾经服用铋剂、PPI、H2受体拮抗剂以及抗菌药物者; (4)孕期及哺乳期者; (5)患者同时服用非甾体抗炎药或酗酒, 或存在其他影响本研究结果的严重疾病, 如严重的肝病、心脏病、呼吸系统疾病等[8]. 共收集305例病人, 年龄19-69岁, 平均年龄53.9岁±13.0岁, 由消化内科医师在内镜下用灭菌活检钳于胃窦小弯侧距幽门5 cm内钳取胃镜深部黏膜组织, 置入含0.9% NaCl溶液的离心管, 于4 h内转送至实验室. 在实验室无菌操作台中将胃镜标本对半均分2份, 其中一份置于脑心浸液肉汤中用于菌种分离培养及药敏检测. 另一份置于无菌Ep管或细胞冻存管内, 做好编号和标记, 用于提取DNA.

1.2 方法

1.2.1H. pylori分离培养和鉴定: 胃黏膜组织经全自动研磨仪充分研磨, 制成组织匀浆后接种于哥伦比亚血平板(5%脱纤维绵羊血), 37 ℃三气培养箱(5% O2、10% CO2、85% N2)微需氧环境下培养96 h, 选取菌落形态典型、经涂片镜检菌体形态符合, 且氧化酶、过氧化氢酶和尿素酶菌试验呈阳性者为H. pylori菌株, 采用生理盐水稀释调浓度至6×108 CFU/mL), 用于后续药敏试验[9].

1.2.2 药物敏感性试验: 选取铋剂四联方案中包含的6种抗生素, 根据美国临床实验室标准化协会推荐方案和判读标准[10], 采用耐药临界点药物琼脂稀释法进行药敏试验: 将抗生素溶液加入琼脂中稀释至该抗生素对应的临界点浓度, 倾倒平板, 接种菌悬液, 若平板上有菌生长则该菌判为耐药菌. 各抗生素的临界点设定标准分别为: 克拉霉素1 μg/mL、左氧氟沙星2 μg/mL、阿莫西林2 μg/mL、盐酸四环素2 μg/mL、呋喃唑酮2 μg/mL、甲硝唑8 μg/mL. 所有实验均重复两次.

1.2.3 耐药突变检测: 采用Qiagen试剂盒提取胃黏膜标本的DNA, 并将DNA浓度调整至10-100 ng/μL用于后续实验.

采用江苏默乐公司的试剂盒, 使用荧光定量PCR法检测H. pylori的克拉霉素及左氧氟沙星耐药突变. 每管反应体系25 μL, 包括: 缓冲液12.5 μL、引物探针7.0 μL、混合酶液0.5 μL、DNA模板5 μL. PCR反应条件为: 42 ℃, 2 min; 95 ℃, 2 min后; 进行95 ℃, 10 s; 58 ℃ 45 s循环40次. 与克拉霉素耐药相关的23S rRNA基因的3种常见突变和喹诺酮类抗生素耐药相关的gyrA基因的6种常见突变如表1所示.

表1 幽门螺杆菌23S rRNA基因与gyrA基因耐药突变.
23S rRNA基因gyrA基因
核苷酸变化突变名称核苷酸变化氨基酸变化
AAA>CAAAsn87LysAAT>AAG天冬酰胺到赖氨酸
AAC>AAA
AAA>GAAAsn87IleAAT>ATT天冬酰胺到异亮氨酸
Asp91AsnGAT>AAT天冬氨酸到天冬酰胺
AAA>AGAAsp91TyrGAT>TAT天冬氨酸到酪氨酸
Asp91GlyGAT>GGT天冬氨酸到甘氨酸

荧光信号的收集定为FAM(克拉霉素耐药突变)、HEX/VIC(喹诺酮类抗生素耐药突变)和CY5(内标), 数据的采集定在58 ℃. 采用ABI7500仪器时, 将"Quencher"一栏设置为"none", "passive reference"一栏选为"none". 结果判读: 对于具有典型S扩增曲线, 且Ct值≤35.00, 判定为阳性.

1.2.4 耐药基因的扩增与测序: 分别针对检H. pylori左氧氟沙星耐药基因gyrA, 克拉霉素耐药基因23S rRNA的核酸序列设计用于PCR的引物, 引物序列如下, 由生工生物(上海)股份有限公司合成.

H. pylori上游引物1(gyrA) : TGGGGATTGATTCTTCTATTGAAGA

H. pylori下游引物1(gyrA) : TGCACTAAAGCGT CTATGATTTCA

H. pylori上游引物2(23SrRNA) : GGTAGCGAA ATTCCTTGTCGGTTA

H. pylori下游引物2(23SrRNA) : GCTTGTGCCA TTACACTCAACTTG

每管PCR反应体系25 μL, 包括: 缓冲液7 μL, 上游引物0.6 μL, 下游引物0.6 μL, Hs Taq酶0.4 μL, ddH2O 11.4 μL. gyrA扩增片段大小均约为550 bp, 23S rRNA扩增片段大小约为410 bp. PCR反应条件为: 95 ℃, 2 min; 95 ℃, 10 s; 58 ℃ 45 s; 72 ℃ 35 s, 共45个循环. PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司.

测序结果使用Chromas软件进行分析, 并与H. pylori野生型基因做对比.

统计数处理 采用Excel软件记录和整理数据, 并运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析, 选择: 分析-描述统计-交叉表, 统计量选择κ和McNemar.

2 结果
2.1 培养及药敏结果

在入组的305例行胃镜检查的病人胃黏膜标本中, 共培养出127株H. pylori菌株. 培养阳性率为41.64%(127/305). 在这127个菌株中, 共有43例对克拉霉素耐药, 57例对左氧氟沙星, 116例对甲硝唑耐药, 耐药率分别为: 33.86%、44.88%、91.34%, 双重耐药率为: 34.65%(44/127), 三重耐药率为18.90%(24/127), 阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮耐药率均为0(0/127).

2.2 耐药突变

使用荧光定量PCR法检测H. pylori的克拉霉素及左氧氟沙星耐药突变, 在127株H. pylori菌株中检测到63例带有23S rRNA基因突变, 72例带有gyrA基因突变.

2.3 耐药基因测序 使用PCR法对克拉霉素及左氧氟沙星耐药突变基因进行扩增, 在127份DNA标本中23S rRNA基因主要突变为A2143G, 54例, 突变频率42.5%(54/127), 其次为A2142G基因型3例, A2142C基因型1例; gyrA基因主要突变为C261A/G, 19例, 突变频率15.0%(19/127), 其次为G271A基因型12例, T261G基因型11例. 使用Excel整理数据, 并运用SPSS 20.0统计软件进行分析, 比较三种耐药检测方法的符合性.

比较荧光定量PCR法检测克拉霉素耐药突变与药敏培养法(表2), 符合性参数Kappa为0.27<0.5, 2种方法一致性低, 灵敏度: 69.8%(30/43); 比较荧光定量PCR法检测克拉霉素耐药突变与测序法, 符合性参数Kappa为0.76>0.5, P<0.05, 表明2种方法一致性好, 灵敏度: 91.4%(53/58).

表2 荧光定量PCR法检测克拉霉素耐药与药敏法和测序法的比较.
荧光定量PCR药敏培养法
测序法
耐药敏感耐药突变野生型
耐药突变30335310
野生型1351559

比较荧光定量PCR法检测左氧氟沙星耐药突变与药敏培养法(表3), 符合性参数Kappa为0.21<0.5, 2种方法一致性低, 灵敏度: 68.4%(39/57); 比较荧光定量PCR法检测左氧氟沙星耐药突变与测序法, 符合性参数Kappa为0.64>0.5, P<0.05, 表明2种方法一致性好, 灵敏度: 94.5%(52/55).

表3 荧光定量PCR法检测左氧氟沙星耐药与药敏法和测序法的比较.
荧光定量PCR药敏培养法
测序法
耐药敏感耐药突变野生型
耐药突变39335220
野生型1837352

4中记录了部分患者H. pylori通过培养法、荧光定量PCR法和测序法检测耐药性的实验结果, 便于比较和分析.

表4 部分患者幽门螺杆菌耐药检测结果.
病人编号克拉霉素
左氧氟沙星
培养PCR法测序法培养PCR法测序法
1<1敏感26.76A2143G≥2耐药24.69C261A
2<1敏感无扩增野生型<2敏感23.95C261A
3≥1耐药21.53A2143G≥2耐药27.92C261A
4≥1耐药23.30A2143G≥2耐药25.41G271T
5<1敏感21.33A2143G<2敏感38.79野生型
6≥1耐药25.73A2143G≥2耐药28.78C261A
7≥1耐药22.08A2143G≥2耐药21.91T261G
8<1敏感24.03A2143G≥2耐药28.73A272G
9≥1耐药21.41A2143G<2敏感36.00野生型
10<1敏感无扩增野生型<1敏感无扩增野生型
11<1敏感25.06A2143G≥2耐药29.44G271A
12≥1耐药30.97A2143G<1敏感无扩增野生型
13<1敏感26.55双峰A2143G<2敏感无扩增野生型
14≥1耐药24.28A2142G≥2耐药29.24A272G
15≥1耐药21.50A2143G≥2耐药19.96T261G
3 讨论

自1985 年H. pylori首次被成功分离培养以来, 其在自然人群中的高感染率及在消化道疾患中的重要致病作用引起了日益广泛的关注. 我国H. pylori的平均感染率已达到50%以上[11,12]. 作为致病菌, H. pylori能够引起胃黏膜炎症反应, 在溃疡的形成中起到重要作用[4]. 根除H. pylori能够促进消化性溃疡愈合, 还可使约80%的早期胃MALT淋巴瘤获得缓解[3,13]. H. pylori感染是目前预防胃癌最重要和可控的因素, 根除H. pylori应该成为预防胃癌的一级措施[14,15].

当前国内的治疗方式主要是经验性治疗, H. pylori对不同抗菌药物的耐药率具有地域差异[16], 检测当地H. pylori 菌株对抗生素的耐药率情况, 根据不同抗菌药物的耐药情况指导本地区H. pylori的根除方案, 具有重要的临床价值. 本实验未发现对阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮抗生素耐药的菌株. 除甲硝唑基本与其他研究者的报道相符, 克拉霉素、左氧氟沙星耐药率均高于浙江地区之前的报道[8,17], 当前H. pylori对多种抗生素耐药性增高的现状需要引起我们的关注.

目前, 国内外常用的根除H. pylori治疗方案包括: 三联法和铋剂四联法. 三联法包括: 克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑, 随着近几年H. pylori对三联法中抗生素的耐药率(包括多重耐药率)上升, 三联法根除率下降, 2017-06中华医学会消化病学分会发布的共识推荐使用经典铋剂四联方案(PPI+铋剂+2种抗生素), 推荐7种方案[4], 见表5中方案1-7.

表5 含铋剂幽门螺杆菌根除四联方案中抗生素组合.
方案抗生素1抗生素2
1阿莫西林克拉霉素
2阿莫西林左氧氟沙星
3阿莫西林呋喃唑酮
4四环素甲硝唑
5四环素呋喃唑酮
6阿莫西林甲硝唑
7阿莫西林四环素
8克拉霉素左氧氟沙星

然而实际应用中, 由于部分抗生素的特殊性, 四环素和呋喃唑酮在国内难以广泛获得, 副反应风险相对较大, 甲硝唑耐药率持续较高且在2017-10被WHO列为2B类致癌物, 实际工作中, 仅有方案1和方案2在临床上认可度较高. 特别是当病人对青霉素过敏时, 阿莫西林不能被使用[18], 治疗方案更加受限, 方案8的抗生素组合使用较多[4,19].

整体上来说, 阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星这3种抗生素是在H. pylori根除治疗中使用最多的药物[20]. 在各地的分析报告中, 阿莫西林耐药率较低(0%-5%), 克拉霉素和左氧氟沙星耐药率(包括多重耐药率)已经很高[21]. 因此临床在使用这些药物前, 需要对病人体内H. pylori耐药情况做相应的评估和分析, 精准地进行个体化治疗, 对于提高病人H. pylori初次治疗根除率, 减少不必要的药物费用和不良反应, 具有重要意义.

H. pylori对克拉霉素和左氧氟沙星产生耐药性的原因[22-24]: 克拉霉素进入细菌细胞后, 结合在核糖体23S rRNA的V区多肽转移环上, 抑制多肽转移酶的移位, 阻止肽链的延长, 从而抑制细菌蛋白质的合成, 达到杀菌目的. 当H. pylori细菌23S rRNA的V区碱基序列发生突变造成空间构象改变, 克拉霉素不能与核糖体V区结构域紧密结合, 细菌蛋白质的合成不受抑制, 从而产生耐药. 左氧氟沙星通过与细菌的DNA螺旋酶结合阻碍细菌复制, 当DNA螺旋酶的亚单位gyrA 氨基酸序列改变造成空间构象改变后, 左氧氟沙星不能与DNA螺旋酶紧密结合, 细菌复制不受抗生素限制, 产生耐药性. 再加上克拉霉素和左氧氟沙星的副作用较小, 抗菌谱较广, 在临床上广泛地应用于控制呼吸系统及泌尿系统感染, 加之早期国内存在抗生素滥用和不规范治疗等因素, 使得病人在进行H. pylori根除治疗前可能已经使用过这些抗生素, 天然性耐药和获得性耐药使得现如今病人体内的H. pylori对抗生素耐药性大大增高.

本实验通过荧光定量PCR法和测序法对临床分离的H. pylori菌株做了耐药性和耐药突变位点的检测, 并与传统的药物敏感实验检测耐药的结果相比较, 探寻不同耐药性检测方法之间的符合率, 用以评估三种耐药性检测方法的灵敏度和准确性. 通过本实验可以看出, 对于克拉霉素和左氧氟沙星耐药性检测, 使用荧光定量PCR的方法与药敏培养法相比较, 一致性不够理想, 灵敏度约70%, 以现有的数据分析结果看来, 本次实验中使用的荧光定量PCR试剂盒相比国外某品牌试剂盒在灵敏度和一致性方面尚有差距[25], 尚需要进行优化, 筛选更好的探针和引物序列, 优化反应条件, 提高反应试剂的灵敏度的和特异性, 增强荧光定量PCR检测耐药突变与临床H. pylori菌株药敏培养的一致性. 值得一提的是, 对于该2种抗生素耐药突变检测, 使用荧光定量PCR的方法与测序法相比较具有很高的一致性和灵敏度. 这两种方法均依托于DNA的扩增, 但测序法需要在DNA扩增后将产物送检测序公司, 得到检测结果用时长, 检测结果需用软件分析比对, 对检测含有野生型和突变型的混合菌株敏感性低, 准确性低[26]; 荧光定量PCR检测耐药突变用时少, 数据直观, 更适宜在临床推广和使用[27].

目前临床判断H. pylori耐药情况主要通过药敏法, 药敏培养H. pylori诊断感染特异性高, 但培养操作步骤繁琐, 敏感性偏低, 药敏培养法不推荐单纯用于H. pylori感染的常规诊断[25,28]. 随着分子生物学技术的发展, 用荧光定量PCR法检测H. pylori耐药基因突变已经成为当今时代临床用以预测耐药的大方向, 具有很高的临床实用价值和科研意义[29].

文章亮点
实验背景

在我国, 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)的平均感染率高达50%以上. H. pylori能够引起胃黏膜炎症反应, 促进溃疡的形成. 根除H. pylori能够促进消化性溃疡愈合, 使约80%的早期胃MALT淋巴瘤获得缓解, 同时能预防胃癌发生. 当前国内的治疗方式主要是经验性治疗, H. pylori对不同抗菌药物的耐药率具有地域差异, 检测当地H. pylori菌株的抗生素的耐药情况, 对于指导本地区H. pylori的根除方案, 具有重要的临床价值.

实验动机

分析浙江地区H. pylori对常用抗生素的耐药率, 包括阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑, 对于本地区治疗中选择敏感的抗生素和最佳根除方案提供指导, 有助于提高治疗H. pylori的根除率. 同时, 研究荧光定量PCR法与药敏法和测序法在检测H. pylori耐药性中的一致性和灵敏度, 分析荧光定量PCR法检测H. pylori耐药性的优点及可行性, 推行个体化治疗用药, 有助于提高H. pylori的首次根除率, 减少抗生素使用时间和花费, 防止长期服用抗生素引起肠道微生物失衡.

实验目标

本实验旨在研究浙江地区H. pylori对常用抗生素的耐药现状, 发现当今经验性治疗下H. pylori对抗生素耐药率较高的情况, 揭示基于耐药检测的H. pylori根除治疗具有必要性. 同时探讨荧光定量PCR法在检测H. pylori耐药性中可行性, 未来应在现有荧光定量PCR检测体系上做出改进和优化, 依靠与其他分子生物学方法相结合、探针和引物筛选、反应条件优化, 提高对H. pylori耐药检测的灵敏度和准确性, 才能更好地在临床推广和使用.

实验方法

在国内研究中, 同时使用三种方法检测H. pylori耐药性尚且不多, 本实验通过培养法、荧光定量PCR法及测序法检测H. pylori耐药性并利用一致性统计研究方法比较三种耐药检测方法的一致性. 本研究选择2017-06/2017-09进行胃镜检查的305例患者, 取胃黏膜组织进行H. pylori菌株分离鉴定, 对分离的127个菌株进行6种抗生素的药敏实验, 提取菌株的DNA, 以荧光定量PCR法和测序法对克拉霉素耐药相关基因23S rRNA和左氧氟沙星耐药相关基因gyrA进行扩增和测序.

实验结果

本实验分离的浙江地区H. pylori菌株中尚无阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮耐药菌株; 克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑耐药率分别为33.86%、44.88%、91.34%、三重耐药率为18.90%; 克拉霉素和左氧氟沙星相关的主要耐药基因及其突变位点分别为23S rRNA(A2143G)、gyrA(C261A/G). 针对铋剂四联法中抗生素在国内应用的情况进行分析, 阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星是H. pylori根除治疗中使用最多的药物, 且H. pylori对克拉霉素、左氧氟沙星的耐药性较高, 因此临床在使用这些药物前, 需要根据H. pylori耐药情况. H. pylori耐药性检测方法包括药敏培养法、测序法和荧光定量PCR法. 不同耐药检测方法的一致性比较: 荧光定量PCR法与测序法检测耐药突变一致性较高, 灵敏度均大于90%, 与药敏培养法一致性相对较差, 灵敏度分别为69.8%(克拉霉素)和68.4%(左氧氟沙星).

实验结论

本研究未发现对阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮抗生素耐药的菌株. 除甲硝唑基本与其他研究者的报道相符, 克拉霉素、左氧氟沙星耐药率均较高, 在临床应用这些抗生素需结合耐药性, 选择敏感的抗生素个体化地用药, 提高根除效率. 三种耐药检测方法: 荧光定量PCR法与传统的药敏培养法检测耐药相比灵敏度为70%, 荧光定量PCR法与测序法相比较具有很高的一致性和灵敏度, 但荧光定量PCR法比测序法操作更加省时、直观、分析结果方便, 更适宜在临床推广和使用.

展望前景

荧光定量PCR体系包括: 引物、探针、模板DNA、底物、高品质的扩增酶及合适的反应条件, 本次实验中使用的荧光定量PCR试剂盒相比国外某品牌试剂盒在灵敏度和一致性方面尚有差距, 尚需要进行优化, 筛选更好的探针和引物序列, 优化反应条件, 提高反应试剂的灵敏度的和特异性, 增强荧光定量PCR检测H. pylori菌株耐药突变的能力.

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

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编辑:马亚娟 电编:张砚梁

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