临床实践 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2018. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2018-05-18; 26(14): 873-878
在线出版日期: 2018-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v26.i14.873
miR-31与miR-182在结直肠癌中表达及临床意义
林德, 王立明
林德, 丽水市人民医院检验科 浙江省丽水市 323000
林德, 副主任医师, 主要从事临床检验研究.
王立明, 丽水市人民医院消化内科 浙江省丽水市 323000
ORCID number: 林德 (0000-0001-6727-1604); 王立明 (0000-0002-7591-6086).
作者贡献分布: 此文由林德与王立明共同完成.
通讯作者: 林德, 副主任医师, 323000, 浙江省丽水市大众街15号, 丽水市人民医院检验科. dxnuq50kiwl0@163.com
收稿日期: 2018-03-20
修回日期: 2018-04-14
接受日期: 2018-04-25
在线出版日期: 2018-05-18

目的

分析miRNA-182与miRNA-31在直肠癌组织内定位与表达状况.

方法

选取2016-12/2017-12间在丽水市人民医院因手术切除的结直肠癌组织标本和正常结直肠黏膜组织20对; 同时收集本院病理科在2010-12/2012-12间保存结直肠癌石蜡标本142例, 分析miRNA-182与miRNA-31在肿瘤组织、正常组织及有无转移肿瘤组织内表达状况.

结果

结直肠癌6株细胞内miR182及miR-31表达间差异有统计学意义(P＜0.05), 转移灶内miR182及miR-31表达量高于原发灶, 差异有统计学意义(P＜0.05); 结直肠癌组织内miR-31表达量高于正常组织, miR-182表达量低于正常组织, 伴发转移结直肠癌组织内miR-31、miR-182表达量高于无转移, 差异均有统计学意义(P＜0.05); 142例结直肠癌石蜡标本中, miRNA-31高表达有75例, 阳性率为52.82%, miRNA-182高表达有81例, 阳性率为57.04%; miR-31及miR-182表达量和患者Dukes's分期、远处转移及淋巴结转移方面差异有统计学意义(P＜0.05).

结论

miR-182和miR-31可加速结直肠癌产生与进展, 具有成为判别结直肠癌转移和预后潜在靶点可能.

关键词: 结直肠癌; 转移; miRNA-182; miRNA-31

核心提要: 本文通过分析miRNA-182与miRNA-31在为直肠癌组织内定位与表达状况, 结果示miR-182和miR-31可加速结直肠癌产生与进展, 具有成为判别结直肠癌转移和预后潜在靶点可能.
引文著录: 林德, 王立明. miR-31与miR-182在结直肠癌中表达及临床意义. 世界华人消化杂志 2018; 26(14): 873-878
Clinical significance of expression of miR-31 and miR-182 in colorectal cancer
De Lin, Li-Ming Wang
De Lin, Department of Laboratory Medicine, People's Hospital of Lishui, Lishui 323000, Zhejiang Province, China
Li-Ming Wang, Department of Gastroenterology, People's Hospital of Lishui, Lishui 323000, Zhejiang Province, China
Correspondence to: De Lin, Associate Chief Physician, Department of Laboratory Medicine, People's Hospital of Lishui, 15 Dazhong Street, Lishui 323000, Zhejiang Province, China. dxnuq50kiwl0@163.com
Received: March 20, 2018
Revised: April 14, 2018
Accepted: April 25, 2018
Published online: May 18, 2018

AIM

To analyze the localization and expression of miRNA-182 and miRNA-31 in colorectal cancer.

METHODS

Twenty pairs of colorectal cancer tissue specimens and normal colorectal mucosal tissues that were surgically resected at People's Hospital of Lishui between December 2016 and December 2017 were selected. Meanwhile, 142 paraffin-embedded specimens of colorectal cancer collected between December 2010 and 2012 at our pathology department were used. The expression of miRNA-182 and miRNA-31 in tumor tissues, normal tissues, and metastases was analyzed.

RESULTS

There was a significant difference in the expression of miR182 and miR-31 among six colorectal cancer cell lines (P < 0.05). The expression of miR182 and miR-31 in the metastatic tumor was significantly higher than that in the primary tumor (P < 0.05). The expression of miR-31 in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues, and the expression of miR-182 was significantly lower than that in normal tissues (P < 0.05). The expression of miR-31 and miR-182 in metastatic colorectal cancer tissues was significantly higher than that in non-metastatic tissues (P < 0.05). Among the 142 paraffin-embedded specimens of colorectal cancer, 75 (52.82%) highly expressed miRNA-31 and 81 (57.04%) highly expressed miRNA-182. The expression of miR-31 and miR-182 was significantly correlated with Dukes stage, distant metastasis, and lymph node metastasis (P < 0.05).

CONCLUSION

miR-182 and miR-31 can accelerate the development and progression of colorectal cancer, and have the potential to become targets for the diagnosis of metastasis and prognosis of colorectal cancer.

Key Words: Colorectal cancer; Metastasis; miRNA-182; miRNA-31
0 引言

结直肠癌为临床较为常见恶性肿瘤, 近些年来, 伴随人们饮食习惯与生活方式变化, 其发病率逐年升高, 对患者身心健康造成了严重影响. 临床结直肠癌患者死亡主要因素为转移, 近半数结直肠癌患者在进行根治手术之前就已经发生了微转移, 这也是患者在手术以后复发与转移直接因素[1-3]. 所以, 了解结直肠癌转移相关分子机制, 对预测和诊断结直肠癌转移对提升患者生存率意义重大. 特定富含AT碱基DNA序列结合蛋白2(specific AT-rich base DNA sequence binding protein 2, SATB2)为重要核基质结合蛋白, 可结合核基质附着区, 在基因表达调控、转录及人染色体组装中起到重要影响[4,5]. 肿瘤内miR-182与miR-31表达含量有异质性, 喉鳞状细胞癌等一些鳞状上皮肿瘤内miR-31表达上升, 加速病情进展, 而在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤内则表达含量比较低, 可抑制肿瘤转移[3,4]. miR-182在肺癌、人乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤内表达含量上升, 加速肿瘤转移, 但其在胃癌内表达量则降低, 可抑制肿瘤形成[6,7]. 因此, 本文通过分析miRNA-182与miRNA-31在为直肠癌组织内定位与表达状况, 为临床患者治疗提供一些实验室依据.

1 材料和方法
1.1 材料

选取2016-12/2017-12间在丽水市人民医院因手术切除的结直肠癌组织标本和正常结直肠黏膜组织20对; 同时收集本院病理科在2016-12/2017-12间保存结直肠癌石蜡标本142例, 标本在手术前都没有进行过放化疗, 固定于10%中性福尔马林固定液内, 石蜡包埋, 3 μm切片.

细胞株: 原发灶来源细胞系: DLD1、HCT116、SW480, 转移灶来源细胞系: SW480/M5、LoVo、SW620, 由本院病理科提供, 本研究经医院伦理委员会批准, 患者及家属知情并签署同意书.

试剂: TaqMan MicroRNA Assay试剂盒(由美国ABI公司生产)、PrimeScriptTM RT reagrnt Kit试剂盒(由美国Promega公司生产), Trizlo、胎牛血清及RPMI1640培养基(由美国Invitrogen公司生产).

仪器: 超低温冰箱(由日本SANYO公司生产)、7500 HT Real-time PCR仪及9700 PCR仪(由美国ABI公司生产)、Milli-Q纯水器(由美国Millipore公司生产).

1.2 方法

培养细胞: DLD1、SW620、HCT116、SW480/M5及SW480使用PRMI 1640 培养液(含有10%灭活胎牛血清)培养, LoVo使用不安全DMEM培养液培养(含有10%灭活胎牛血清), 选择生长较好细胞进行实验.

抽提细胞与组织总RNA后进行逆转录反应, 依据PrimeScriptTM RT reagrnt Kit试剂盒的说明书来进行操作, 相关操作均在冰上进行.

荧光定量PCR反应, 使用7500 HT Real-time PCR行SYBRgreen荧光定量PCR反应, Folds = 2﹣△△Ct代表不同细胞与组织内miRNA的表达状况, △△Ct = (CtSATB2－CtGAPDH)samples－(CtSATB2－CtGAPDH)normal average.

miRNA原位杂交, 依据FFPE in situ hybridization(由丹麦Exiqon公司生产)说明书来进行操作. 结果评估: 阳性信号定位在细胞浆内, DAB显色是黄褐色, NBT/BCIP是蓝黑色; (1)依据切片显色强度: 强阳性3分(棕黄色/蓝黑色), 中等阳性2分(黄色/蓝色), 弱阳性1分(浅黄色/浅蓝色), 阴性0分(无限色); (2)显色的癌细胞百分比: 4分为76%至100%, 3分为51%至75%, 2分为26%至50%, 1分为1%至25%, 0分为0%, 患者肿瘤阳性强度 = (1)+(2), 高于3分为高表达.

统计学处理 使用SPSS19.0统计软件进行数据分析, 计量资料用(mean±SD)表示, 6株细胞间表达状况单因素方差分析, 正常组织、癌组织及有无转移癌症间对比采用配对样本t和独立样本t检验, 计数资料χ²检验, P＜0.05差异有统计学意义.

2 结果
2.1 miR182及miR-31在结直肠癌细胞株内表达状况

结直肠癌6株细胞内miR182及miR-31表达间差异有统计学意义(P＜0.05), 转移灶内miR182及miR-31表达量高于原发灶, 差异有统计学意义(P＜0.05), 详见表1.

表1 miR182及miR-31在结直肠癌细胞株内表达状况对比.
2﹣△△Ct
LoVoDLD1SW620HCT116SW480/M5SW480
miR-315.67 ± 1.851.02 ± 0.164.50 ± 1.493.04 ± 0.059.62 ± 3.150.99 ± 0.14
F16.821
P＜0.05
miR18210.96 ± 3.871.39 ± 0.2513.78 ± 4.515.08 ± 1.3819.01 ± 5.371.37 ± 0.15
F17.852
P＜0.05
2.2 结直肠癌、正常组织及有无转移中miR182及miR-31表达状况

结直肠癌组织内miR-31表达量高于正常组织, miR-182表达量低于正常组织, 伴发转移结直肠癌组织内miR-31、miR-182表达量高于无转移, 差异均有统计学意义(P＜0.05), 详见表2.

表2 结直肠癌、正常组织及有无转移中miR182及miR-31表达状况对比.
正常组织结直肠癌tP伴发转移无转移tP
miR-310.13 ± 0.051.70 ± 0.0712.372＜0.0561.53 ± 2.197.85 ± 2.3414.007＜0.05
miR-1821.16 ± 0.610.46 ± 0.5813.681＜0.055.76 ± 1.031.95 ± 1.0111.652＜0.05
2.3 结直肠癌患者病理参数和miR-31表达量联系状况

142例结直肠癌石蜡标本中, 高表达有75例, 阳性率为52.82%; miR-31表达量和患者Dukes's分期、远处转移及淋巴结转移方面差异有统计学意义(P＜0.05), 详见表3.

表3 结直肠癌患者病理参数和miR-31表达量联系状况对比 n (%).
病理参数n低表达高表达χ2P
年龄 (岁)1.028＞0.05
≥507734 (44.16)43 (55.84)
＜506533 (50.77)32 (49.23)
性别0.984＞0.05
男性8841 (46.59)47 (53.41)
女性5426 (48.15)28 (51.85)
肿瘤部位2.169＞0.05
近端结肠4121 (51.22)20 (48.78)
远端结肠3619 (52.78)17 (47.22)
直肠6527 (41.54)38 (58.46)
肿瘤大小 (cm)0.853＞0.05
≥59948 (48.48)51 (51.52)
＜54319 (44.19)24 (55.81)
分化程度1.442＞0.05
高分化126 (50.00)6 (50.00)
中分化10549 (46.67)56 (53.33)
低分化2512 (48.00)13 (52.00)
淋巴结转移10.287＜0.05
是8629 (33.72)57 (66.28)
否5638 (67.86)18 (32.14)
远处转移13.682＜0.05
是4815 (31.25)33 (68.75)
否9452 (55.32)42 (44.68)
Dukes's分期11.409＜0.05
A、B6037 (61.67)23 (38.33)
C、D8230 (36.59)52 (63.41)
2.4 结直肠癌患者病理参数和miR-182表达量联系状况

142例结直肠癌石蜡标本中, 高表达有81例, 阳性率为57.04%; miR-182表达量和患者Dukes's分期、远处转移及淋巴结转移方面差异有统计学意义(P＜0.05), 详见表4.

表4 结直肠癌患者病理参数和miR-182表达量联系状况对比 n (%).
病理参数n低表达高表达χ2P
年龄 (岁)2.163＞0.05
≥507735 (45.45)42 (54.55)
＜506526 (40.00)39 (60.00)
性别0.824＞0.05
男性8833 (37.50)55 (62.50)
女性5428 (51.85)26 (48.15)
肿瘤部位1.967＞0.05
近端结肠4118 (43.90)23 (56.10)
远端结肠3615 (41.67)21 (58.33)
直肠6528 (43.08)37 (56.92)
肿瘤大小 (cm)0.950＞0.05
≥59942 (42.42)57 (57.58)
＜54319 (44.19)24 (55.81)
分化程度1.335＞0.05
高分化127 (58.33)5 (41.67)
中分化10541 (39.05)64 (60.95)
低分化2513 (52.00)12 (48.00)
淋巴结转移12.094＜0.05
是8624 (27.91)62 (72.09)
否5635 (62.50)21 (37.50)
远处转移10.651＜0.05
是4811 (22.92)37 (77.08)
否9450 (53.19)44 (46.81)
Dukes's分期13.076＜0.05
A、B6036 (60.00)24 (40.00)
C、D8225 (30.49)57 (69.51)
3 讨论

Croce在2002年首次报道了肿瘤和miRNA异常间的联系状况, 而后越来越多相关研究证实肿瘤的形成和进展中miRNA有重要影响, 部分miRNA分子甚至被认为药物治疗靶点及诊断肿瘤标志物, 其在肿瘤诊疗及分型和预后方面有重要应用价值[8-11]. 某一个miRNA/基因在其病理、生理进程中出现改变对其功能解释有重要提示[12-14]. 近些年来, 临床普遍使用检测miRNA金标准为荧光定量PCR, 美国ABI公司所生产试剂盒对于扩增成熟miRNA的准确度、灵敏度和特异度较高, 对相差仅有一个碱基相似的miRNA也能够准确定量[15-18].

本文研究显示, miR-182和miR-31在转移灶细胞株(LoVo、SW620、SW480/M5)内表达量高于原发灶细胞株(HCT116、DLD1、SW480), 同时miR-182和miR-31在伴发转移组织内表达量也高于不伴转移, 说明miR-182及miR-31和结直肠癌患者转移有联系. 已有研究显示, miR-31结直肠癌组织内表达水平高于正常对照组织, 这和本文研究结果一致[19,20]. 肿瘤组织内除了有肿瘤细胞以外, 还有内皮细胞、成纤维细胞等间质成分和原器官组织等多种成分, 当研究对象是整块组织时一般会造成病变组织丰富度变低, 非病变组织生物信息会将病变生物信息淹没, 对患者病情无法真实反映[21]. 原位杂交技术则可以直观展现细胞学定位与miRNA表达组织器官类型, 将非瘤成分对结果造成的干扰排除. 本文研究显示, 142例结直肠癌石蜡标本中, 高表达有75例, 阳性率为52.82%; 142例结直肠癌石蜡标本中, 高表达有81例, 阳性率为57.04%; miR-31及miR-182表达量和患者Dukes's分期、远处转移及淋巴结转移方面差异有统计学意义. 当前多数专家认为miRNA能够经过和靶基因mRNA编码区域不完全/完全配对, 对mRNA翻译抑制或者降解, 为机体基因表达转录以后水平负性调控主要方式. 同时越来越多相关研究显示, miRNA可以经过对靶蛋白表达进行负性调控对肿瘤形成与进展发挥重要影响. 发现miRNA不同调节方式, 使人们对靶mRNA分子机制认识更加丰富, 展现了细胞中基因表达调控多层次网络系统[22].

总之, miR-182和miR-31可加速结直肠癌产生与进展, 具有成为判别结直肠癌转移和预后潜在靶点可能.

文章亮点
实验背景

临床结直肠癌患者死亡主要因素为转移, 近半数结直肠癌患者在进行根治手术之前就已经发生了微转移, 这也是患者在手术以后复发与转移直接因素. 了解结直肠癌转移相关分子机制, 对预测和诊断结直肠癌转移对提升患者生存率意义重大.

实验动机

肿瘤内miR-182与miR-31表达含量有异质性, 喉鳞状细胞癌等一些鳞状上皮肿瘤内miR-31表达上升, 加速病情进展, 而在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤内则表达含量比较低, 可抑制肿瘤转移. miR-182在肺癌、人乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤内表达含量上升, 加速肿瘤转移, 但其在胃癌内表达量则降低, 可抑制肿瘤形成.

实验目标

本文通过分析miRNA-182与miRNA-31在为直肠癌组织内定位与表达状况, 为治疗临床患者提供一些实验室依据.

实验方法

选取因手术切除的结直肠癌组织标本和正常结直肠黏膜组织20对; 同时收集本院病理科保存结直肠癌石蜡标本142例, 分析miRNA-182与miRNA-31在肿瘤组织、正常组织及有无转移肿瘤组织内表达状况. 使用SPSS19.0统计软件进行数据分析, 计量资料用(mean±SD)表示.

实验结果

结直肠癌6株细胞内miR182及miR-31表达间差异有统计学意义, 且转移灶内miR182及miR-31表达量高于原发灶; 结直肠癌组织内miR-31表达量高于正常组织, 而miR-182表达量低于正常组织, 伴发转移结直肠癌组织内miR-31、miR-182表达量高于无转移; 均具有统计学意义(P＜0.05); 142例结直肠癌石蜡标本中, miRNA-31高表达有75例; 且miR-31及miR-182表达量和患者Dukes's分期、远处转移及淋巴结转移方面差异有统计学意义(P＜0.05).

实验结论

通过研究发现, miR-182和miR-31可加速结直肠癌产生与进展, 具有成为判别结直肠癌转移和预后潜在靶点可能.

展望前景

由于人力及时间等限制, 本文仅分析了miRNA-182与miRNA-31在肿瘤组织、正常组织及有无转移肿瘤组织内表达状况, 在今后还需进一步学习相关理论知识, 探究miRNA-182与miRNA-31对结直肠癌细胞生物学特性影响, 为临床患者治疗提供更多帮助.

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

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编辑:马亚娟 电编:张砚梁

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