修回日期: 2015-01-16
接受日期: 2015-01-22
在线出版日期: 2015-03-18
目的: 观察单味中药枳实含药血清对大鼠胃窦平滑肌细胞收缩效应及细胞内Ca2+、钙调蛋白表达的影响.
方法: 按照血清药理学通法制备大鼠枳实含药血清, 将血清分为枳实组(10%、20%、50%枳实含药血清)、空白血清对照组, 酶解法提取胃窦平滑肌细胞并进行培养, 倒置显微镜下观察各组对胃窦平滑肌细胞收缩效应, 激光共聚焦显微镜技术检测各组加药前后胃窦平滑肌细胞内Ca2+浓度变化, 免疫组织化学方法观察各组对胃窦平滑肌细胞内钙调蛋白的表达.
结果: 10%、20%、50%枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞收缩及细胞内Ca2+荧光强度的影响呈药物剂量依赖关系, 细胞收缩、细胞内Ca2+荧光强度随药物浓度的增高而增强(P<0.05) , 20%、50%枳实含药血清与空白血清对照组对胃窦平滑肌细胞收缩、细胞内Ca2+荧光强度差异有统计学意义(P<0.05), 50%枳实组与空白血清对照组对胃窦平滑肌细胞内钙调蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05).
结论: 枳实含药血清可以促进胃窦平滑肌细胞收缩, 其机制可能与增加细胞内Ca2+浓度、调节钙调蛋白的表达有关.
核心提示: 10%、20%、50%枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞的收缩及其对细胞内Ca2+荧光强度的影响呈对应关系, 50%枳实含药血清可增强胃窦平滑肌细胞内钙调蛋白的表达, 这提示着枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞的收缩、细胞内Ca2+变化、钙调蛋白的表达有着相关性.
引文著录: 李东鑫, 凌江红, 王煜姣, AkarayosapongPichamon, 宁海恩, 张智, 刘培凤. 枳实含药血清对大鼠胃窦平滑肌细胞收缩效应及细胞内钙离子浓度、钙调蛋白表达的影响. 世界华人消化杂志 2015; 23(8): 1224-1230
Revised: January 16, 2015
Accepted: January 22, 2015
Published online: March 18, 2015
AIM: To observe the effect of drug-containing serum of single herb immature bitter orange on cell contraction, intracellular Ca2+ concentration and calmodulin expression in rat antral smooth muscle cells.
METHODS: Rat drug-containing serum of immature bitter orange was prepared using the routine method. The drug-containing serum was divided into different concentration groups (10%, 20%, and 50% drug-containing serum), and normal serum was used as a blank control. Antral smooth muscle cells were extracted using enzymatic method and cultured. The effect of each group of serum on antral smooth muscle cell contraction was observed under an inverted microscope. The changes of intracellular Ca2+ concentration in the antral smooth muscle cells were tested using confocal laser scanning microscopy. Calmodulin expression in antral smooth muscle cells was detected using immunohistochemical method.
RESULTS: The effect of drug-containing serum of immature bitter orange on antral smooth muscle cell contraction and intracellular Ca2+ fluorescence intensity was dose-dependent. Cell contraction and intracellular Ca2+ fluorescence intensity increased with the increase of drug concentration (P < 0.05). Antral smooth muscle cell contraction and intracellular Ca2+ fluorescence intensity differed significantly between the 20% and 50% drug-containing serum groups and the blank control group (P < 0.05). Antral smooth muscle intracellular calmodulin expression differed significantly between the 50% drug-containing serum group and the blank control group (P < 0.05).
CONCLUSION: The drug-containing serum of immature bitter orange can promote antral smooth muscle cell contraction possibly via mechanism related to the increase of intracellular Ca2+ concentration and the modulation of calmodulin expression.
- Citation: Li DX, Ling JH, Wang YJ, Pichamon A, Ning HE, Zhang Z, Liu PF. Effect of drug-containing serum of immature bitter orange on cell contraction, intracellular Ca2+ concentration and calmodulin expression in rat antral smooth muscle cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2015; 23(8): 1224-1230
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v23/i8/1224.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v23.i8.1224
枳实是一种重要的理气药, 归脾、胃经, 具有破气消积、化痰散痞的作用, 用于积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻胸痹、结胸、胃下垂[1]等症. 枳实的破气作用较强, 临床上常与其他药物组方, 如"枳实消痞丸"、"枳实导滞丸"、"枳术丸"等[2-5], 对胃肠运动功能障碍有良好的调整作用. 有研究[6]证实枳实含药血清对大鼠胃肠平滑肌条有兴奋作用. 胃肠平滑肌的收缩活动与胞内Ca2+浓度变化密切相关, 而调控细胞内Ca2+释放也是调控平滑肌舒缩活动的有效途径[7]. 钙调蛋白是一种广泛存在于生物体的Ca2+结合蛋白, 钙调蛋白能与Ca2+结合, 形成有活性的Ca2+, 并能与靶蛋白相互作用产生一系列的生理效应使平滑肌收缩[8]. 本研究将从细胞水平进一步证实枳实的促胃动力作用, 并基于钙离子的变化及钙调蛋白的表达来探讨其作用机制.
枳实、吗丁啉均由广西医科大学第一附属医院药房提供. 50只SPF级SD大鼠购自广西医科大学实验动物中心. Ⅱ型胶原酶购自美国GIBCO公司; M199培养液购自美国Hyclone公司; 青霉素-链霉素溶液、0.25%胰酶+0.02%EDTA、D-Hanks液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司; 胎牛血清购自美国SCIENCELL公司; 水合氯醛、25%戊二醛购自成都科龙试剂公司; Fluo-3-AM购自北京泛博生物化学有限公司.
1.2.1 动物含药血清的制备与血清分组: 按文献[9,10]制备含药血清, 取SD大鼠18只, 雌雄不限, 用简单随机分组法分为枳实组、空白血清对照组, 分别予枳实煎液[(按成人60 kg/人)临床用药量的10倍, 按1:5容积比, 用蒸馏水浸泡30 min, 煎煮2次(30 min/次)后, 过滤, 去渣取汁, 合并滤液加热蒸发, 制成1.015 kg/L水煎浓缩液, 4 ℃保存备用]、生理盐水灌胃, 灌胃量1.5 mL/100 g, 2次/d, 间隔12 h, 共3 d; 于末次灌胃后1 h后10%水合氯醛腹腔麻醉, 从腹主动脉取血, 置真空采血管室温下静置至有血清析出, 3000 r/min离心20 min, 分离血清, 同组血清混合后, 置于56 ℃水浴中灭活30 min, 用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌, 置-20 ℃保存备用. 假设所提取的枳实含药血清浓度为100%, 用胎牛血清稀释成10%、20%、50%的枳实含药血清浓度(如10%的枳实组配置: 10 mL枳实含药血清+90 mL胎牛血清).
1.2.2 胃平滑肌细胞的提取及培养: 参考相关文献[11,12]中的SD大鼠胃窦平滑肌细胞的分离方法并进行适当调整, 取SD大鼠2只, 雌雄不限, 禁食8 h, 不禁水, 用10%水合氯醛腹腔麻醉, 开腹取胃窦, 所取胃窦长约3 cm, 行胃小弯切开, 用D-Hanks液冲洗3次, 在解剖显微镜下行胃黏膜层的剥离, 剩下的肌条切成0.1 cm×0.1 cm大小的条块. 取到的肌条放入含有Ⅱ型胶原酶(用不含血清的M199配成1.3 mg/mL)的消化液中, 在37 ℃水浴箱消化30 min, 消化后再离心1000 r/min、5 min, 用D-Hanks液重悬沉淀, 吹打10 min, 再1000 r/min离心5 min, 吸去D-Hanks液, 加入培养基(含有M199, 100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素, 20%胎牛血清), 吹打均匀后, 用200目筛网过筛后形成细胞悬液, 分装到细胞培养瓶中培养, 每瓶约4 mL细胞悬液, 放入37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养. 每隔3 d换液1次, 倒置显微镜下观察细胞生长情况. 待细胞达到80%时, 经胰蛋白酶消化传代[13]. 当细胞生长稳定后, 用血球计数板计数细胞数在1×105/mL左右, 台盼蓝染色确定细胞活力在80%左右时可用于检测.
1.2.3 枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞收缩效应的影响: 将上述符合要求的细胞加入24孔培养板中, 每个孔250 mL细胞悬液, 平均分为5组, 每组4个孔, 待细胞贴壁后, 分别加入10%枳实组、20%枳实组、50%枳实组、空白血清对照组, 每个孔板加入50 μL含药血清, 反应1 min后, 加入2.5%的戊二醛固定, 后放入倒置显微镜下观察细胞并拍照. 后用Image-Pro Plus 6.0测量不同组的胃窦平滑肌细胞的长轴变化.
1.2.4 枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞内Ca2+浓度的影响: 将培养稳定的平滑肌细胞制成细胞悬液加入培养皿中, 平均分为5组, 置于37 ℃恒温箱待细胞贴壁后经D-Hanks液清洗, 在避光的情况下加入0.1 mL(10 μmol/L, 含有5 μL/mL的Pluronic F-127)Fluo-3-AM标记细胞内Ca2+, 于37 ℃恒温箱中避光孵育60 min, 再经D-Hanks液清洗后, 在激光共聚焦显微镜下上机检测. 测定时将培养皿置于载物台上, 寻找最佳视野, 分别加入上述5组配置好的含药血清, 动态扫描细胞内Ca2+荧光强度(fluorescent intensity, FI)的变化, 用FI平均变化值来间接反映细胞内游离Ca2+浓度的相对水平. 先检测加药前的FI值(静息值), 加药物后再次测量FI值(峰值), 峰高(△FI) = 峰值-静息值, 代表药物引起的FI变化值[14], 细胞荧光强度使用自带软件NIS测定.
1.2.5 免疫组织化学方法观察各组胃窦平滑肌细胞内钙调蛋白的表达: 将培养稳定的细胞种于24孔板中的细胞爬片内, 平均分为4组, 每组6个孔, 当细胞贴壁稳定后, 分别加入上述4组含药血清, 每个孔板加入50 μL含药血清, 反应2 min后, 加入冰冻甲醇固定10 min, 5%脱脂奶粉封闭10 min, 加入一抗(calmodulin antibody 1:50), 4 ℃冰箱孵育过夜, PBS液冲洗3遍, 加入结合荧光素山羊抗兔IgG抗体(1:100)标记二抗, 37 ℃培养箱孵育1 h, 抗淬灭封片液封片后置荧光显微镜下观察并拍照. 设每一组中留1孔不加一抗仅加二抗孵育的样本作阴性对照. 以胞浆着色为染色阳性细胞. 免疫组织化学结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分. 以随机15个100倍视野阳性细胞数所占百分比打分: 0分为阳性细胞数≤5%, 1分为阳性细胞数占6%-25%, 2分为阳性细胞数占26%-50%, 3分为阳性细胞数占51%-75%, 4分为阳性细胞数>75%; 染色强度: 0分无染色, 1分淡绿色, 2分绿色, 3分深绿色. 两者乘积>1分为阳性, ≤1分为阴性[15].
统计学处理 完全随机设计两样本比较的t检验分析各组之间对胃窦平滑肌细胞收缩效应及对细胞内钙离子浓度影响的差异, 完全随机设计四格表资料χ2检验分析各组对钙调蛋白表达的差异, 数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计分析. P<0.05为差异具有统计学意义.
10%、20%、50%枳实组对胃窦平滑肌细胞收缩的影响呈药物剂量依赖关系, 细胞收缩随药物浓度的增高而增强, 20%枳实组、50%枳实组与空白血清对照组对胃窦平滑肌细胞收缩比较差异有统计学意义(P<0.01)(表1, 图1).
10%、20%、50%的枳实含药血清对细胞内Ca2+荧光强度呈药物剂量依赖关系, 细胞内Ca2+荧光强度随剂量的增加而增强, 50%枳实组对细胞内Ca2+荧光强度影响最大, 20%枳实组与空白血清对照组对细胞内Ca2+荧光强度比较差异有统计学意义(P<0.05), 50%枳实组与空白血清对照组对细胞内Ca2+荧光强度比较差异有统计学意义(P<0.01)(表2, 图2).
10%、20%、50%的枳实含药血清对大鼠胃窦平滑肌细胞内钙调蛋白表达阳性率分别为40.0%、53.3%、86.7%, 随着血清中枳实浓度的增加, 阳性率增加. 统计学比较中只有空白血清对照组与50%枳实组的比较差异有统计学意义(P<0.05)(表3, 图3).
| 分组 | 阳性数(n) | 阴性数(n) | 阳性率(%) |
| 空白血清对照组 | 5 | 10 | 33.3 |
| 10%枳实组 | 6 | 9 | 40.0 |
| 20%枳实组 | 8 | 7 | 53.3 |
| 50%枳实组 | 13 | 2 | 86.7a |
枳实行滞降泄力强, 长于破滞气 、行痰湿 、消积滞 、除痞满, 为胃肠气分药, 在治疗胃肠疾病的经验由来已久, 《名医别录》中枳实有"降胸胁痰癖, 逐停水, 破结石, 消胀满......胁风痛, 安胃气, 止溏泄"的记载. 前人在动物实验中发现枳实煎液可明显提高小鼠小肠碳末推进率[16,17], 能改善功能性消化不良大鼠的胃排空[18-20], 可增加兔离体胃底平滑肌条的张力[21], 枳实厚朴提取液能显著改善左旋精氨酸所致的大鼠胃动力障碍[22]. 本研究结果显示20%、50%浓度的枳实含药血清与空白血清对照组相比能增加胃窦平滑肌细胞的收缩, 本研究从细胞水平上进一步证实了枳实的促胃动力作用.
有相关研究[23,24]证实枳实促胃动力作用机制可能与P物质、下丘脑内的胆囊收缩素与生长抑素等有关, 而具体的机制还未十分明确. 在胃肠平滑肌收缩与舒张的信号转导机制中, 细胞内游离Ca2+作为一种重要的第二信使广泛的参与细胞的运动、分泌、代谢和分化等多种细胞功能活动的调节, 平滑肌的收缩变化跟胞外Ca2+内流、细胞内Ca2+的释放密切关联, 高浓度Ca2+可引起平滑肌收缩, 低浓度的Ca2+可引起平滑肌舒张[25]. 本研究中结果显示低中高浓度的枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞收缩及细胞内Ca2+荧光强度的影响呈药物剂量依赖关系, 细胞收缩、细胞内Ca2+荧光强度随药物浓度的增高而增强, 枳实含药血清对平滑肌细胞的收缩效应可能跟增加细胞内Ca2+浓度有关, 实验中所用的细胞缓冲液是无钙的D-Hanks液, 结合上述理论我们可以推断枳实含药血清促进胃窦平滑肌细胞的收缩可能是通过调节细胞内钙库Ca2+的释放增加细胞内Ca2+浓度来完成的. 关于细胞内钙库Ca2+的释放, 胞内存在两种钙释放通道, 肌醇三磷酸(IP3)和RYR(ryanodine)受体通道, 将Ca2+从钙库中释放出来[26]. 钙调蛋白是细胞内Ca2+信号传导途径中的主要信号转导分子, 介导调控由Ca2+引起的一系列生理生化反应, 参与并调节细胞的增生、分化、运动等基本代谢过程[27]. 当细胞内Ca2+浓度增高时, 通过一系列的反应使钙调蛋白结合蛋白磷酸化, 肌丝滑行使平滑肌细胞收缩[28-30]. 有研究[31]证实钙调蛋白可能参与IP3协调的Ca2+从钙池的释放, 本研究中结果显示50%枳实组对胃窦平滑肌细胞内钙调蛋白表达最明显, 基于上述分析, 枳实含药血清可能通过调节钙调蛋白的表达、平滑肌细胞内Ca2+浓度增加来参与胃窦平滑肌细胞的收缩. 其具体的促胃动力机制还需进一步从IP3通道的分子水平来研究. 总之, 枳实对胃肠运动调节的机制是个十分复杂的过程, 本研究在枳实促胃动力机制的方面提供了一些研究方向, 为做下一步的研究奠定了基础.
胃动力障碍疾病是临床常见胃肠道疾病之一, 是以胃肠运动异常、出现胃平滑肌缩下降、 张力低的一系列疾病, 中药枳实在促胃动力方面的研究前人已经做过许多报道, 但其具体的促胃动力机制还不十分明确, 而在Ca2+及钙调蛋白分子水平的研究还未有相关报道.
唐文富, 教授, 主任医师, 四川大学华西医院中西医结合科
近年来对枳实组方用药促胃肠动力的药理药效及枳实成分提取的研究较多, 对单味枳实的促胃肠动力机制研究较欠缺, 许多涉及细胞分子水平的研究还待解决.
杨秀丽就有关枳实在胃肠动力方面机制的报道, 枳实对胃肠的作用因动物种属和功能状态不同而异, 其作用机制与胆囊收缩素(CCK)、生长抑素(SS)、H1受、P物质等都有着相关性.
本实验通过制备枳实含药血清, 通过观察枳实含药血清对胃窦平滑肌细胞收缩效应, 再从其对细胞内钙离子浓度、钙调蛋白表达的影响探讨枳实的促胃动力机制.
钙离子、钙调蛋白与平滑肌的收缩有着密切相关, 本研究证实枳实促胃动力机制可能与此相关, 并对枳实的临床用药可以提供相应的理论依据.
本文有一定的理论指导价值.
编辑: 郭鹏 电编: 闫晋利
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