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世界华人消化杂志. 2014-03-18; 22(8): 1141-1145
在线出版日期: 2014-03-18. doi: 10.11569/wcjd.v22.i8.1141
三叶因子3在肝细胞癌组织中的表达及临床意义
尚允利, 钱叶本
尚允利, 钱叶本, 安徽医科大学第一附属医院普外科 安徽省合肥市 230032
尚允利, 枞阳县人民医院普外科 安徽省安庆市 246702
尚允利, 主治医师, 主要从事肝癌分子生物学的研究.
作者贡献分布: 此课题由尚允利与钱叶本设计; 研究过程由尚允利操作完成; 研究所用新试剂与分析工具由尚允利提供; 数据分析由尚允利完成; 本论文写作由尚允利与钱叶本完成.
通讯作者: 钱叶本, 教授, 博士, 230032, 安徽省合肥市绩溪路218号, 安徽医科大学第一附属医院普外科. qianyeben@hotmail.com
电话: 0551-62922114
收稿日期: 2013-12-26
修回日期: 2014-01-13
接受日期: 2014-01-16
在线出版日期: 2014-03-18

目的: 探讨三叶因子3(trefoil factor 3, TFF3)在人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中表达及其与患者临床病理特征和预后的关系.

方法: 建立组织微阵列平台, 应用免疫组织化学两步法检测90例HCC肿瘤组织和90例癌旁非肿瘤组织中TFF3的表达情况.

结果: HCC肿瘤组织中TFF3阳性表达率为62.1%, 癌旁非肿瘤组织中TFF3阳性表达率为33.8%, 两者之间差异具有统计学意义(P<0.01); HCC肿瘤组织中TFF3蛋白的表达与肿瘤的大小以及肿瘤TNM分期分别呈显著正相关(P = 0.026和0.015), 与患者的无复发生存期呈负相关(P = 0.043).

结论: TFF3可能参与HCC的发生和进展, 可以作为判定HCC预后的一种潜在标志物.

关键词: 肝脏肿瘤; 三叶因子3; 免疫组织化学

核心提示: 本文使用组织微阵列平台, 应用免疫组织化学两步法检测肝细胞癌三叶因子3(trefoil factor 3, TFF3)的表达状况, 结果显示TFF3在肝细胞癌中过表达, 并且与病程进展和患者预后生存期相关, 提示TFF3可能参与肝细胞癌的发生和进展, 可以作为判定肝细胞癌预后的一种潜在标志物.


引文著录: 尚允利, 钱叶本. 三叶因子3在肝细胞癌组织中的表达及临床意义. 世界华人消化杂志 2014; 22(8): 1141-1145
Clinical significance of expression of trefoil factor 3 in hepatocellular carcinoma
Yun-Li Shang, Ye-Ben Qian
Yun-Li Shang, Ye-Ben Qian, Department of Surgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
Yun-Li Shang, Department of Surgery, the People's Hospital of Zongyang, Anqing 246702, Anhui Province, China
Correspondence to: Ye-Ben Qian, Professor, Doctor, Department of Surgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 218 Jixi Road, Hefei 230032, Anhui Province, China. qianyeben@hotmail.com
Received: December 26, 2013
Revised: January 13, 2014
Accepted: January 16, 2014
Published online: March 18, 2014

AIM: To investigate clinical significance of expression of trefoil factor 3 (TFF3) in hepatocellular carcinoma (HCC).

METHODS: The expression of TFF3 was examined by immunohistochemical method on tissue chips containing 90 cases of HCC and 90 cases of non-tumor hepatic tissues.

RESULTS: The positive rate of TFF3 expression in HCC was significantly higher than that in non-tumor hepatic tissues (62.1% vs 33.8%, P < 0.01). TFF3 expression was significantly correlated with tumor size, TNM stage (P = 0.026 and 0.015) and relapse-free survival (P = 0.043).

CONCLUSION: TFF3 may play an important role in the development and progression of HCC, and the expression of TFF3 might be a potential marker for evaluating the prognosis of HCC.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; Trefoil factor 3; Immunohistochemistry


0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)一种常见的恶性肿瘤, 其发病率和死亡率在全球范围内有逐年增高趋势[1]. 由于HCC临床早期症状不明显, 难以做到早期发现早期治疗, 因此很多患者术后肿瘤常见复发转移, 导致远期生存率不佳[2]. 因此, 研究HCC发生发展的分子机制, 发掘其中重要的调控分子, 确定有效的生物学标志物和治疗靶点, 对提高HCC患者的治疗效果和生存质量有着重要意义[3]. 三叶因子3(trefoil factor 3, TFF3)是在1991年由Suemori[4]从大鼠空肠中发现的, 分子仅由59个氨基酸组成, 含有1个P结构域, 存在单聚体和二聚体两种形式, 主要分布于肠黏膜. 近年来, TFF3在肿瘤中的作用日益受到重视. 目前TFF3在肝细胞癌中的研究鲜有报道, 本研究采用免疫组织化学技术检测HCC肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织TFF3的表达, 分析其与HCC临床病理特征关系, 探讨其在HCC发病过程中的生物学意义.

1 材料和方法
1.1 材料

收集2004-01/2007-08安徽医科大学第一附属医院普外科HCC病例90例, 患者平均年龄51.5岁±11.6岁. 按第6版国际抗癌协会TNM分期标准进行临床分期, Edmondson分级标准进行组织学分级. 所有HCC患者均有详细生存资料, 包括术后总生存期和术后无复发生存期, 并且术前均未做化疗、免疫或放射治疗. 另收集每例病例手术标本中距离肿瘤组织边缘2 cm以外的非肿瘤性肝组织. 所有组织均以40 g/L中性甲醛固定过夜, 石蜡包埋, 常规行苏木精-伊红(HE)染色, 经组织病理诊断证实. 浓缩型鼠抗人TFF3单克隆抗体购于美国Abcam公司, 工作浓度1:100. 通用型EnVision两步法免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥公司.

1.2 方法

1.2.1 组织微阵列制备: 首先, 复查每例标本HE染色切片, 选取代表性组织位点, 然后使用显微镜定位器进行定位. 每例病例选取4枚组织(癌组织和癌旁非肿瘤组织各2枚); 使用组织微阵列制备仪制作7×8点阵的空白蜡块; 选取内径为1.5 mm的取样针, 在相应组织蜡块上找到取样位置, 通过取样、点样, 经过二次包埋后制成的组织微阵列蜡块. 每枚蜡块为56个组织点阵, 即包含56枚组织点; 以4 μm厚度连续切片, 敷贴于10%多聚赖氨酸预先处理的载玻片上.

1.2.2 免疫组织化学检测TFF3的表达及结果判定: 具体免疫组织化学操作按说明书染色步骤进行. 以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照, 余步骤相同. 采用双盲法, 由两位病理医师独立观察. TFF3以细胞胞质内出现淡黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞. TFF3阳性细胞计数: 每个样本随机计数5个高倍视野(400倍)的阳性细胞数, 计算每个视野的阳性率, 得出平均数, 按下列方法进行评分: 阳性细胞<33%为1分, 33%-67%为2分, >67%为3分; 阳性细胞着色深度: 无着色或弱表达为1分, 棕黄色为2分, 棕褐色为3分. 将两项积分相乘: ≥4分被认为是阳性, 反之为阴性[5].

统计学处理 采用SPSS10.0软件进行统计学分析. 其中样本阳性率之间比较采用χ2检验, 阳性率与患者临床病理特征之间关系采用非参数Spearman等级相关检验, 患者生存率的组间比较采用Kaplan-Meier生存曲线法及Log-rank检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 TFF3蛋白的表达及分布

TFF3阳性染色主要定位于细胞胞质(图1). HCC肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中均有不同程度的TFF3阳性表达. 90例HCC肿瘤组织中TFF3阳性表达率为62.1%, 90例癌旁非肿瘤组织中TFF3阳性表达率为33.8%, 两者之间差异具有统计学意义(P<0.01)(表1).

表1 TFF3在肝细胞癌和癌旁非肿瘤组织中表达 [n = 90, n(%)].
分组TFF3
阴性阳性
肝细胞癌 39(37.9) 64(62.1)b
非肿瘤组织 51(66.2) 26(33.8)
图1
图1 肝细胞癌和癌旁非肿瘤组织中TFF3的表达(×200). A: 肝细胞癌; B: 癌旁非肿瘤组织. TFF3: 三叶因子3.
2.2 TFF3蛋白表达与HCC临床病理特征的关系

HCC肿瘤组织中TFF3蛋白的表达与肿瘤大小及临床TNM分期均呈显著正相关(P = 0.026和P = 0.015), 而与患者年龄、性别、组织学分级、HBsAg感染和肝硬化状况均无显著相关性(P>0.05)(表2).

表2 肝细胞癌组织中TFF3蛋白表达与患者临床病理特征的关系 n(%).
临床病理特征nTFF3P
年龄(岁) 0.543
≤55 54 32(59.3)
>55 36 19(52.8)
性别 0.458
73 40(54.8)
17 11(64.7)
肝硬化 0.435
81 47(58.0)
9 4(44.4)
HBsAg 0.458
阳性 73 40(54.8)
阴性 17 11(64.7)
肿瘤大小(cm) 0.026
<5 26 10(38.5)
≥5 64 41(64.1)
组织学分级 0.150
I 11 9(81.8)
II 68 35(51.5)
III 11 7(63.6)
临床分期 0.015
I - II 67 33(49.3)
III - IV 23 19(78.3)
2.3 TFF3蛋白表达与肝细胞癌患者预后的关系

采用Kaplan-Meier曲线法和Log-rank检验对肿瘤细胞TFF3表达与HCC患者总生存率和无复发生存率关系进行单因素生存分析: TFF3阳性表达患者无复发生存率显著低于阴性表达患者(P = 0.043). TFF3阳性表达患者总生存率低于阴性表达患者, 但未达到统计学意义(P = 0.062)(图2).

图2
图2 TFF3表达与肝细胞癌患者预后的关系. A: 无复发生存率; B: 总生存率. TFF3: 三叶因子3.
3 讨论

近年来, TFF3是研究较多的小分子多肽三叶因子家族成员之一, 研究发现其过度表达是多种恶性肿瘤预后不良的表现之一, 可能在促进肿瘤演进方面发挥了重要作用. Yamachika[6]研究发现TFF3具有抑制胃癌细胞黏附、促进细胞侵袭和阻断细胞凋亡的作用. Taupin等[7]通过制造大鼠胃黏膜病变模型, 发现在从胃黏膜化生到不典型增生再到胃癌这一过程中, TFF3的表达逐步增高, 提示TFF3可能参与了胃黏膜恶性转化的过程, 其表达的改变可能是胃黏膜癌变的早期分子事件. Chan等[8]也发现在胃癌组织中TFF3存在异常表达, 并能够上调Rat-2细胞中侵袭相关基因的表达. 体内外研究显示: TFF3可以促进鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成, 从而诱导人脐静脉内皮细胞形成类微血管结构, 提示其可能参与了血管生成[9]. Dhar等[5]研究显示TFF3能够促进胃癌的转移和复发, 其机制可能是TFF3在肿瘤微血管生成方面扮演重要角色. 细胞周期、DNA修复、血管生成和凋亡等都涉及到相关基因的CpG岛甲基化, CpG岛甲基化在肿瘤发生、发展过程中可能发挥着关键作用[10]. Okada等[11]发现TFF3的过表达参与了肝脏肿瘤的发生, 异常的启动区CpG岛甲基化可能对TFF3表达发挥重要的调控作用, 由此推测肝癌组织可能通过启动区CpG岛甲基化促进TFF3的表达, 进而影响血管生成, 促进肿瘤的侵袭、转移, 其具体机制还有待进一步证实.

目前国内关于TFF3在HCC中的表达及其与预后相关性的研究尚未见报道. 本研究采用免疫组织化学方法检测肝脏肿瘤中TFF3蛋白表达情况, 结果显示, HCC肿瘤组织TFF3表达显著高于癌旁非肿瘤组织, 结果与皮肤黏液癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤报道一致[5,12-15], 提示其可能参与了HCC的发生过程. Yamachika等[6]应用免疫组织化学方法检测209例原发性胃腺癌病理组织标本, 结果显示TFF3在胃癌患者中表达率女性明显高于男性, 并且在男性胃癌患者中TFF3表达与进展状况、浸润性生长以及肿瘤淋巴结转移有关, 提示TFF3高表达可能是胃癌患者预后不良的标志. 本研究结果显示, 肝细胞癌肿瘤组织中TFF3表达与年龄、性别、分化程度以及淋巴结转移无关, 但与肿瘤的大小以及临床TNM分期呈显著正相关, 提示TFF3参与HCC的发生、发展过程, 可能是一种HCC预后不良的标志物. Dhar等[5]发现TFF3可作为胃癌患者的无复发生存率的独立评价预后指标, 提示TFF3高表达的胃癌患者具有较高的复发风险. 本研究进一步显示TFF3表达与HCC患者的无复发生存率呈显著负相关, 结合文献报道, 提示TFF3可能作为HCC预后不良的一种标志物.

总之, TFF3作为HCC发生过程中的重要因子, 可能参与了HCC恶性转化和进展的过程, 是患者预后不良的一个潜在标志物. TFF3基因可能成为HCC新的分子标志物, 对HCC的早期诊断、评估预后及治疗模式的选择有着重要的临床参考价值.

评论
背景资料

研究肝细胞癌发生发展的分子机制, 确定有效的生物学标志物和治疗靶点, 对提高患者的治疗效果和生存质量有着重要意义.

同行评议者

孙星, 副教授, 副主任医师, 上海交通大学附属第一人民医院普外科

研发前沿

近年研究发现三叶因子3(trefoil factor 3)表达在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用, 但在肝细胞癌中的研究鲜有报道.

相关报道

Yamachika应用免疫组织化学方法检测了胃腺癌TFF3表达, 发现TFF3表达与肿瘤进展状况、浸润性生长以及肿瘤淋巴结转移有关. Dharet发现TFF3可作为胃癌患者的无复发生存率的独立评价预后指标.

创新盘点

本文在国内首次大样本检测了肝细胞癌和癌旁非肿瘤组织TFF3表达, 并分析其与患者临床病理特征和预后的关系.

同行评价

肝细胞癌是一种常见的、预后差的恶性肿瘤, 治疗效果一直不佳. 该研究结果提示TFF3可能参与了肝细胞癌发生发展进展, 提示TFF3可能用于肝细胞癌治疗和预后判定的一个潜在靶点.

编辑: 郭鹏 电编: 鲁亚静

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