VEGF165b重组蛋白与贝伐珠单抗对人胃癌裸鼠移植瘤CD34表达及细胞凋亡的影响

摘要

目的: 对比观察VEGF₁₆₅b重组蛋白(recombinant human VEGF₁₆₅b protein, rhVEGF₁₆₅b)与贝伐珠单抗对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及作用机制.

方法: 用人胃癌细胞BGC-823接种于裸鼠皮下, 建立裸鼠移植瘤模型, 随机分为3组, 每组21只: rhVEGF₁₆₅b组(腹腔注射rhVEGF₁₆₅b 10 μg/kg)、贝伐珠单抗组(腹腔注射贝伐珠单抗5 mg/kg)、对照组(腹腔注射生理盐水10 mL/kg), 分别于1、2、3 wk测量裸鼠移植瘤体积及瘤质量, 免疫组织化学方法检测肿瘤组织中CD34表达(以阳性细胞数计算肿瘤微血管密度), TUNEL方法检测肿瘤组织细胞凋亡.

结果: 贝伐珠单抗组移植瘤体积(cm³)及瘤质量(g)在第1、2、3周均小于对照组(1 wk: 0.453±0.119 vs 0.637±0.084, 0.32±0.097 vs 0.46±0.093; 2 wk: 1.691±0.381 vs 2.238±0.29, 1.168±0.524 vs 2.013±0.833; 3 wk: 1.709±0.474 vs 4.872±0.594, 1.747±0.557 vs 3.463±0.986, 均P<0.05), 而rhVEGF₁₆₅b组仅在第1、2周较对照组小(1 wk: 0.546±0.132 vs 0.637±0.084, 1.894±0.599 vs 0.46±0.093; 2 wk: 1.894±0.599 vs 2.238±0.29, 1.537±0.568 vs 2.013±0.833, 均P<0.05), 第3周其体积及瘤质量大于贝伐珠单抗组(3 wk: 3.843±1.339 vs 1.709±0.474, 3.066±1.281 vs 1.747±0.557, P<0.05), 与对照组无明显差异. rhVEGF₁₆₅b组、贝伐珠单抗组CD34的表达水平在第1、2、3周均低于对照组(P<0.05, P<0.01), 凋亡指数高于对照组(P<0.05, P<0.01); 与贝伐珠单抗组相比, 第1周rhVEGF₁₆₅b组CD34的表达水平更低(P<0.05), 但第2、3周却高于贝伐珠单抗组(P<0.01); rhVEGF₁₆₅b组的凋亡指数在第1周明显高于贝伐珠单抗组(P<0.01), 而第2、3周却低于贝伐珠单抗组(P<0.05).

结论: rhVEGF₁₆₅b、贝伐珠单抗对人胃癌移植瘤的生长有明显抑制作用, rhVEGF₁₆₅b早期抑制血管生成、促进细胞凋亡表现更为明显.

关键词: VEGF₁₆₅b重组蛋白; 贝伐珠单抗; 胃癌; 微血管密度; 凋亡

核心提示: VEGF₁₆₅b重组蛋白(recombinant human VEGF₁₆₅b protein, rhVEGF₁₆₅b)、贝伐珠单抗对人胃癌移植瘤的生长有明显抑制作用, rhVEGF₁₆₅b早期抑制血管生成、促进细胞凋亡表现更为明显.

Effect of recombinant human VEGF₁₆₅b protein and bevacizumab on expression of CD34 and cell apoptosis in human gastric carcinoma xenografts in nude mice

Hai-Rong Wu, Yun-Yan Guan, Xi-Ping Wu, Jing-Fen Zhu

Hai-Rong Wu, Yun-Yan Guan, Xi-Ping Wu, ICU, Affiliated Wuxi Hospital, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Wuxi 214001, Jiangsu Province, China

Jing-Fen Zhu, Department of Gastroenterology, Affiliated Wuxi Hospital, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Wuxi 214001, Jiangsu Province, China

Supported by: the Science Foundation of Wuxi Medical Center, No. YGZ1021.

Correspondence to: Yun-Yan Guan, Associate Chief Physician, ICU, Affiliated Wuxi Hospital, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, 33 Houxixi Road, Wuxi 214001, Jiangsu Province, China. guanyuny@163.com

Received: August 6, 2013
Revised: September 8, 2013
Accepted: February 3, 2014
Published online: March 18, 2014

Abstract

AIM: To investigate the effect of recombinant human VEGF₁₆₅b protein (rhVEGF₁₆₅b) and bevacizumab on expression of CD34 and cell apoptosis in human gastric carcinoma xenografts in nude mice.

METHODS: Thirty male nude mice were used to establish the human gastric carcinoma xenograft model. The mice were randomly divided into three groups: a rhVEGF₁₆₅b group (intraperitoneal injection, 10 μg/kg), a bevacizumab group (intraperitoneal injection, 5 mg/kg) and a control group. Tumor growth was detected by measuring tumor volume and weight. The expression of CD34 and apoptosis of tumor cells were detected by immunohistochemistry and TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay at weeks 1, 2 and 3, respectively.

RESULTS: Tumor volume and weight at weeks 1 and 2 in the rhVEGF₁₆₅b group (week 1: 0.546 ± 0.132 vs 0.637 ± 0.084, 1.894 ± 0.599 vs 0.46 ± 0.093; week 2: 1.894 ± 0.599 vs 2.238 ± 0.29, 1.537 ± 0.568 vs 2.013 ± 0.833; P < 0.05 for all) and at weeks 1, 2 and 3 in the bevacizumab group (week 1: 0.453 ± 0.119 vs 0.637 ± 0.084, 0.320 ± 0.097 vs 0.460 ± 0.093; week 2: 1.691 ± 0.381 vs 2.238 ± 0.290, 1.168 ± 0.524 vs 2.013 ± 0.833; week 3: 1.709 ± 0.474 vs 4.872 ± 0.594, 1.747 ± 0.557 vs 3.463 ± 0.986, P < 0.05 for all) were significantly smaller than those in the control group. At week 3, tumor volume and weight were significantly larger in the rhVEGF₁₆₅b group than in the bevacizumab group (3.843 ± 1.339 vs 1.709 ± 0.474, 3.066 ± 1.281 vs 1.747 ± 0.557, P < 0.05 for both). Microvascular density (MVD) and apoptosis index (AI) at weeks 1, 2 and 3 in the rhVEGF₁₆₅b group and bevacizumab group were significantly different from those in the control group. MVD and AI also differed significantly between the rhVEGF₁₆₅b group and bevacizumab group.

CONCLUSION: Both rhVEGF₁₆₅b and bevacizumab can inhibit the growth of human gastric carcinoma cells possibly by inhibiting angiogenesis and inducing apoptosis, with rhVEGF₁₆₅b having a more significant effect in early stage.

Key Words: Recombinant human VEGF₁₆₅b protein; Bevacizumab; Gastric carcinoma; Microvascular density; Apoptosis

0 引言

目前, 恶性肿瘤已超过心脑血管疾病而位居致死原因的首位[1,2]. 有研究表明, 肿瘤的生长与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达密切相关[3,4], VEGF₁₆₅是体内最多的亚型. VEGF₁₆₅b作为VEGF的新型剪接变构体, 具有抑制VEGF₁₆₅所诱导的血管内皮细胞增殖、迁移生成的作用[5], 目前尚无VEGF₁₆₅b对胃癌作用方面的研究. 本研究通过与贝伐珠单抗比较, 探讨rhVEGF₁₆₅b对胃癌的治疗作用、机制, 从而为能否以VEGF₁₆₅b为新靶点治疗该病提供初步的理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌细胞株BGC-823为本实验室传代培养; ♀Balb/c裸鼠, 4-5周龄, 体质量12-15 g, 购自上海斯莱克实验动物有限公司, SPF级条件饲养; 贝伐珠单抗注射液: Roche Pharma(Schweiz) Ltd, 批号: B3426; rhVEGF₁₆₅b: R&D, 批号: HNC0910101; TUNEL原位检测试剂盒, 南京凯基, 货号: KGA7022; CD34抗体, 武汉博士德生物有限公司, 货号: BA0532; SP试剂盒, 福州迈新生物科技有限公司, 货号: kit-9999; 日本OLYMPUS显微镜IX51.

1.2 方法

1.2.1 移植瘤模型建立: 收集培养的人低分化前胃癌细胞BGC-823悬液, 浓度为1×10⁷个/mL, 取0.1 mL接种于裸鼠右侧腋窝皮下, 注射局部出现明显皮丘, 8 d后所有裸鼠均出现75-100 mm³大小的皮下结节, 移植瘤模型建立成功.

1.2.2 分组: 已成功建立皮下移植瘤模型的裸鼠随机分为对照组、贝伐珠单抗组及rhVEGF₁₆₅b组, 每组21只, 3 d给药1次. 贝伐珠单抗组予腹腔注射贝伐珠单抗5 mg/kg, rhVEGF₁₆₅b组予腹腔注射rhVEGF₁₆₅b 10 μg/kg, 对照组给予等量生理盐水溶液. 于第1、2、3周测量瘤体体积及瘤质量, 并留取标本.

1.2.3 移植瘤体积及瘤质量测定: 于第1、2、3周分别用游标卡尺测量肿瘤的长度、宽度, 肿瘤体积V = 1/2×a×b². V为肿瘤体积, a、b分别为肿瘤的长短径. 处死裸鼠后剥离瘤组织, 称取瘤质量.

1.2.4 CD34的表达: 瘤体甲醛固定, 石蜡包埋切片, 脱蜡, 采用CD34抗体, SP免疫组织化学方法, DAB显色, 苏木素复染, 棕黄色环形为血管阳性表达. 微血管密度(microvascular density, MVD)计数结果判定, 参照Weidner方法[6], 先在低倍镜(×10)下扫视整个切片, 选取高血管密度区, 再在高倍镜(×40)下计数被染成棕黄色的血管数目, 取3个视野的平均值.

1.2.5 TUNEL方法检测细胞凋亡: 按照试剂盒说明书进行操作, 用DNA酶处理过的切片为阳性对照, 以PBS替代TUNEL反应液为阴性对照, 光学显微镜下取5个高倍视野观察拍照, 凋亡细胞为棕黄色, 正常细胞为蓝紫色, 计算出细胞凋亡指数(AI) = 凋亡细胞数/肿瘤细胞总数×100%.

统计学处理 用Stata8.0软件进行分析, 计量资料数据均以mean±SD表示, 统计采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 移植瘤体积、瘤质量的变化

贝伐珠单抗组移植瘤体积及瘤质量在第1、2、3周均小于对照组(P<0.05), 而rhVEGF₁₆₅b组仅在第1、2周较对照组小(P<0.05) , 第3周其体积及瘤质量大于贝伐珠单抗组(P<0.05), 与对照组无明显差异(表1, 2, 图1, 2).

表1 移植瘤体积的比较 (cm³).

分组	第1周	第2周	第3周
贝伐珠单抗组	0.453±0.119a	1.691±0.381a	1.709±0.474a
rhVEGF165b组	0.546±0.132a	1.894±0.599a	3.843±1.339c
对照组	0.637±0.084	2.238±0.29	4.872±0.594

^aP<0.05 vs 对照组;

^cP<0.05 vs 贝伐珠单抗组.

图1 各组移植瘤不同时间点瘤体积.

表2 移植瘤瘤质量的比较 (g).

分组	第1周	第2周	第3周
贝伐珠单抗组	0.32±0.097a	1.168±0.524a	1.747±0.557a
rhVEGF165b组	0.41±0.111a	1.537±0.568a	3.066±1.281c
对照组	0.46±0.093	2.013±0.833	3.463±0.986

^aP<0.05 vs 对照组;

^cP<0.05 vs 贝伐珠单抗组.

图2 各组移植瘤不同时间点瘤质量.

2.2 移植瘤组织CD34的表达及MVD

CD34主要表达于血管内皮细胞胞膜, 呈棕黄色至棕褐色, 逗点状、小管状或条索状, 分布不均呈异质性. rhVEGF₁₆₅b组、贝伐珠单抗组MVD在第1、2、3周均低于对照组(P<0.05、P<0.01), 而rhVEGF₁₆₅b组在第1周时MVD较贝伐珠单抗组低(P<0.05), 第3周却高于贝伐珠单抗组(P<0.01)(表3, 图3).

表3 移植瘤MVD值.

分组	第1周	第2周	第3周
贝伐珠单抗组	20.86±4.18a	20±2.517b	16.14±2.41b
rhVEGF165b组	16.57±2.299bc	20.14±3.671b	36.57±3.207bd
对照组	27.43±2.992	38.14±6.914	48.86±5.872

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 贝伐珠单抗组.

图3 各组移植瘤组织CD34的表达(×200). A: 对照组; B: 贝伐珠单抗组; C: rhVEGF₁₆₅b组.

2.3 移植瘤细胞的凋亡指数

TUNEL检测阳性反应物质呈棕黄色, 主要位于细胞核中, 凋亡细胞呈散在或簇状分布. 与对照组相比, rhVEGF₁₆₅b组、贝伐珠单抗组凋亡指数均明显增加, 第1、2、3周均有显著差异(P<0.05、P<0.01); 但rhVEGF₁₆₅b组凋亡指数于第1周明显高于贝伐珠单抗组(P<0.01), 第2、3周却低于贝伐珠单抗组(P<0.01)(表4, 图4).

表4 移植瘤凋亡指数.

分组	第1周	第2周	第3周
贝伐珠单抗组	2.08±2.092a	14.25±1.394b	29.88±5.179b
rhVEGF165b组	6.11±1.479bd	10.13±1.688bd	19.91±3.082bd
对照组	0.25±0.176	1.42±0.725	1.07±0.721

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组;

^dP<0.01 vs 贝伐珠单抗组.

图4 移植瘤组织TUNEL检测细胞凋亡(×200). A: 对照组; B: 贝伐珠单抗组; C: rhVEGF₁₆₅b组.

3 讨论

肿瘤的生长和转移均依赖于血管的形成, 在促进血管生成因子中, 作用最强且研究最广泛的就是VEGF. VEGF₁₆₅是体内最多的亚型, 其生物活性最强且cDNA扩增丰度最高, 故在临床和动物实验中应用最广. 但在2002年Bates等[7]分离出VEGF的新型剪接变构体-VEGF₁₆₅b, 其选择性剪接发生于外显子8的远端, 在结构上与VEGF₁₆₅相比, 仅表现为终末6个氨基酸的不同, 但其可和VEGF₁₆₅竞争性地与VEGFR₂结合, 但仅能部分激动VEGFR₂[8], 从而起到抑制VEGF₁₆₅所诱导的内皮细胞增殖、迁移及血管舒张、血管生成的作用. VEGF₁₆₅b也能与VEGFR₁受体结合, 但亲合力的大小目前还不明确[9]. 研究显示VEGF₁₆₅b广泛表达于正常组织中, 而在肾细胞癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、糖尿病患者眼组织中及先兆子痫胎盘中表达均下调[10-12], 在且应用外源性VEGF₁₆₅b抑制了新生血管及肿瘤的生长[13]. 另外, VEGF₁₆₅/VEGF₁₆₅b的变化也与肾脏足细胞分化状态有关, 在分化的足细胞VEGF₁₆₅b表达增高[14,15]. Rennel等[16]将结肠癌细胞种植于裸鼠颈背部皮下, 24 h后或肿瘤直径达4-5 mm时开始皮下或腹腔内注射重组VEGF₁₆₅b蛋白, 结果也显示VEGF₁₆₅b抑制了该肿瘤的生长, 且这一作用呈剂量依赖型, 但不影响血液动力学及肝脏的功能和形态学变化. 除此之外, VEGF₁₆₅b也有抑制激光诱导的脉络膜新生血管生成的作用[17].

目前针对VEGF的靶向治疗主要包括VEGF单克隆抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂. 贝伐珠单抗属于单克隆抗体, 是直接作用于VEGF的人源化单克隆抗体, 含有93%人IgG骨架及7%鼠源结合区域. 可与VEGF结合, 阻止其与内皮细胞表面的VEGFR结合, 特异封闭VEGF的生物学功能, 如内皮细胞有丝分裂原活性、血管通透性、血管生成活性等[18,19]. 临床试验显示, 贝伐珠单抗与抗肿瘤方案联合治疗胃癌, 可明显提高生存率、显著延长患者的生存期[20], 但目前尚缺乏评估对该药敏感性的生物学指标. Yamashita-Kashima等[21]应用9种不同类型的人胃癌细胞株构建移植瘤模型, 其中有6种胃癌细胞株(包括GXF97、MKN-45、MKN-28、4-1ST、SC-08-JCK和SC-09-JCK)对贝伐珠单抗敏感, 另外3种(SCH、SC-10-JCK和NCI-N87)对其不敏感, 而且VEGF表达水平可以作为判断对该药是否敏感的生物学指标. 由此可见, 贝伐珠单抗并不是对所有类型的胃癌有效, 且由于单克隆抗体常有免疫原性, 而且在某些组织中可诱导血管退行性变[22], 而实验显示VEGF₁₆₅b对生理性血管生成没有影响[23], 因此从这方面看来VEGF₁₆₅b比贝伐珠单抗具有一定的优越性.

我们的前期实验显示, 与癌旁正常组织相比, 胃癌组织中也有VEGF₁₆₅b表达的下调, 因此我们推测rhVEGF₁₆₅b也具有抑制胃癌生长的作用. 在实验中, 我们以BGC-823细胞株构建了胃癌的动物模型, 观察并比较了rhVEGF₁₆₅b和贝伐珠单抗对胃癌移植瘤的作用, 结果显示rhVEGF₁₆₅b具有抑制瘤体血管生成和促进癌细胞凋亡的作用, 因此也就抑制了胃癌裸鼠移植瘤的生长, 这种效应在第1、2周比较明显, 但第3周时rhVEGF₁₆₅b作用则弱于贝伐珠单抗, 这可能与后期随着肿瘤的增长VEGF₁₆₅b重组蛋白的剂量亦需相应增加有关. 尽管如此, 我们可以看出rhVEGF₁₆₅b有望成为治疗胃癌的新选择.

评论

背景资料

恶性肿瘤已超过心脑血管疾病而位居致死原因的首位. 胃癌是常见消化系统恶性肿瘤之一, 严重危害人类生命和健康, 如何提高治疗效果仍然是世界范围内关注的课题.

同行评议者

张小晋, 主任医师, 北京积水潭医院; 蒋敬庭, 教授, 常州市第一人民医院(苏州大学附属第三医院)肿瘤生物诊疗中心

研发前沿

研究表明肿瘤的生长与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达密切相关, VEGF₁₆₅是体内最多的亚型, 其生物活性最强且cDNA扩增丰度最高, VEGF₁₆₅b作为VEGF的新型剪接变构体,具有抑制VEGF₁₆₅所诱导的血管内皮细胞增殖、迁移生成的作用.

相关报道

有研究表明, 补充VEGF₁₆₅b对肾细胞癌、前列腺癌、结肠癌新生血管生成及肿瘤的生长有一定的抑制作用.

创新盘点

目前尚无VEGF₁₆₅b对胃癌作用方面的研究,通过与贝伐珠单抗比较, 探讨rhVEGF₁₆₅b对胃癌的治疗作用、机制.

应用要点

rhVEGF₁₆₅b具有抑制瘤体血管生成和促进癌细胞凋亡的作用,抑制了胃癌裸鼠移植瘤的生长, 以VEGF₁₆₅b为新靶点治疗提供初步的理论依据.

同行评价

本文设计合理, 实验方法得当, 结论可信, 论文质量较好, 有科学性.

备注

编辑: 田滢 电编: 鲁亚静

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