曲古菌素A作用胃癌细胞SGC-7901后GDF-15的表达及其在胃腺癌组织中的表达

摘要

目的: 研究生长分化因子-15(growth differentiation factor-15, GDF-15)基因在曲古菌素A(trichostatin A, TSA)作用胃癌细胞系SGC-7901后及胃腺癌组织中的表达.

方法: 采用Real-time PCR检测胃癌细胞系SGC-7901经过TSA干预后GDF-15基因表达的变化, 免疫组织化学检测GDF-15基因在胃癌及癌旁正常组织中的表达.

结果: GDF-15基因在胃癌细胞系SGC-7901经75 ng/mL TSA作用48 h后, 表达下调, 差异具有显著性(P<0.05), 免疫组织化学显示胃腺癌组织中GDF-15基因表达明显高于周围正常胃组织(P<0.05).

结论: GDF-15基因表达下降可能在TSA促胃癌细胞系SGC-7901凋亡中发挥作用. GDF-15基因在胃腺癌组织中表达增高.

关键词: 生长分化因子-15; 胃癌; 曲古菌素A; SGC-7901

核心提示: 生长分化因子-15(growth differentiation factor-15, GDF-15)在肿瘤进程中发挥双向作用. 早期GDF-15抑制肿瘤生长和诱导凋亡; 晚期促进细胞增殖、迁移、侵袭和转移. GDF-15在进展期胃癌中表达增高, 故GDF-15基因表达下降可能在曲古菌素A(trichostatin A)促胃癌细胞系SGC-7901凋亡中发挥作用.

Expression of GDF-15 in trichostatin A-treated gastric cancer SGC-7901 cells and in gastric adenocarcinoma tissues

Yun-Long Li, Wu Cui, Xiao-Lin Li, Hao Wang, Yu Tian, Zhi-Gang Cao, Bai-Feng Tong, Xiao-Ming Zou

Yun-Long Li, Wu Cui, Xiao-Lin Li, Hao Wang, Yu Tian, Zhi-Gang Cao, Bai-Feng Tong, Xiao-Ming Zou, Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150080, Heilongjiang Province, China

Supported by: Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of Ministry of Education, No. 20102307120014; Harbin Technological Innovation Talent Research Special Fund, No. 2009RFQX016.

Correspondence to: Yun-Long Li, Associate Professor, Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 246 Xuefu Road, Nangang District, Harbin 150080, Heilongjiang Province, China. hydeyll.student@sina.com

Received: January 22, 2014
Revised: February 24, 2014
Accepted: March 8, 2014
Published online: April 8, 2014

Abstract

AIM: To examine the expression of growth differentiation factor-15 (GDF-15) in gastric cancer SGC-7901 cells treated with TSA and in gastric carcinoma tissues.

METHODS: GDF-15 gene expression in gastric cancer cell line SGC-7901 after TSA treatment was detected by real-time PCR, and GDF-15 protein expression in gastric cancer and tumor-adjacent normal tissues was detected by immunohistochemistry.

RESULTS: GDF-15 gene expression was significantly down-regulated in gastric cancer cell line SGC-7901 treated with 75 ng/mL TSA for 48 h (P < 0.05). Immunohistochemistry analysis demonstrated that GDF-15 protein expression in gastric adenocarcinoma was significantly higher than that in tumor-adjacent gastric tissue (P < 0.05).

CONCLUSION: Down-regulation of GDF-15 gene expression may play a role in TSA-induced apoptosis of SGC-7901 cells. GDF-15 protein expression is increased in gastric carcinoma.

Key Words: Growth differentiation factor-15; Gastric cancer; Trichostatin A; SGC-7901

0 引言

生长分化因子-15(growth differentiation factor-15, GDF-15)又称前列腺衍生因子(prostate-derived factor, PDF)、非甾体抗炎药激活基因-l(non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene 1, NAG-1)、巨噬细胞抑制因子-1(macrophageinhibitory cytokine-1, MIC-1), 在不同的细胞类型、疾病阶段和肿瘤微环境中发挥抑制和促进癌症进程的双重作用[1-7]. 癌症早期阶段, GDF-15发挥抑制作用, 抑制肿瘤生长和诱导凋亡; 但在晚期, GDF-15则促进细胞增殖、迁移、侵袭和远处转移. Lee等[8]的研究显示胃癌细胞系中GDF-15过表达可增加细胞的侵袭能力. 我们在研究中发现一定剂量曲古菌素A(trichostatin A, TSA)作用胃癌细胞系SGC-7901后可导致SGC-7901细胞凋亡[9], 进一步分析显示TSA作用胃癌细胞系SGC-7901后能诱导SGC-7901细胞部分基因表达的改变. 为此, 我们应用Real-time PCR检测TSA作用胃癌细胞系SGC-7901后GDF-15基因的表达, 并对进展期胃癌组织中GDF-15的表达进行检测, 以初步分析GDF-15基因在胃癌疾病进程中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

胃癌细胞系SGC-7901由黑龙江省肿瘤防治研究所惠赠. TSA(分子式C₁₇H₂₂N₂O₃, 相对分子质量302.4, 纯度98%, Sigma公司), RPMI 1640培养基(Gibco公司), 胎牛血清(四季青公司), TRIzol(Invitrogen公司), ExScript™ RT-PCR试剂盒、Premix Ex Taq™试剂盒(TaKaRa公司), Mx4000荧光定量PCR仪(Stratagene公司), 兔抗人GDF-15多克隆抗体(Abcam公司), SP试剂盒及AEC显色剂(福州迈新生物技术有限公司)等.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: SGC-7901细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中, 常规细胞培养, 取对数生长期细胞进行实验. 实验分2组: 对照组给予全RPMI 1640培养液, 实验组给予含TSA(终浓度75 ng/mL)[9]的RPMI 1640全培养液, 于37 ℃、5%CO₂培养箱中继续培养48 h后实验.

1.2.2 GDF-15基因Real-time PCR检测: (1)细胞总RNA的提取: 根据Invitrogen公司的TRIzol操作说明书进行. 紫外分析测定所抽提RNA的浓度; (2)逆转录获得cDNA: 根据TaKaRa公司的ExScript™ RT-PCR试剂盒操作说明书进行. 得到的产物置于-80 ℃保存备用; (3)Real-time PCR检测: 引物设计及Real-time PCR检测委托上海吉凯基因化学有限公司进行. 引物序列如下: GDF-15正向: 5'-GTTGCGGAAACGCTACGA-3'; GDF-15反向: 5'-AACAGAGCCCGGTGAAGG-3'. GAPDH正向: 5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'; GAPDH反向: 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'. 产物片段分别为210、121 bp. PCR反应条件: 设定程序为两步法Real-time. PCR预变性95 ℃ 15 s; 之后每一步变性95 ℃ 5 s; 退火延伸60 ℃ 30 s; 共进行45个循环. 每次在延伸阶段读取吸光值, 收集数据进行Real-time分析. 制作熔解曲线: PCR结束后, 95 ℃变性1 min, 然后冷却至55 ℃, 使DNA双链充分结合. 从55 ℃开始到95 ℃, 每一步增加0.5 ℃, 保持4 s, 同时读取吸光值.

1.2.3 免疫组织化学: 40例进展期胃腺癌与40例其癌旁5 cm正常胃组织标本为2012-2013年我科手术切除标本, 按SP免疫组织化学染色步骤进行操作, 用已知表达抗体的组织作阳性对照, PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照, 具体步骤按说明书进行. GDF-15阳性染色主要定位于细胞质中, 光镜下双盲法计数阳性细胞. 阳性细胞为胞浆出现棕黄色颗粒. 于上、下、左、右、中各随机选择至少5个高倍视野(×400), 计数不少于1000个细胞, 并统计阳性细胞数[10].

统计学处理 Real-time PCR数值分析采用2^-∆∆Ct分析法, 仪器软件Stratagene公司自动分析给出表达比值(expression ratio = 2^-∆∆Ct), 使用SPSS13.0统计分析软件进行ANVOVA方差分析, P<0.05为差异有统计学意义. 免疫组织化学数据处理采用SPSS13.0统计分析软件, 应用χ2检验对GDF-15在胃腺癌、正常胃组织中的表达结果进行分析, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 GDF-15基因Real-time PCR

一定剂量TSA作用SGC-7901细胞48 h后GDF-15基因表达下降, 对照组2^-∆∆Ct均值为1.001, 标准偏差为0.07355248, 实验组2^-∆∆Ct均值为0.389, 标准偏差为0.04190327, P值

为0.01947725, P<0.05, 二者表达差异具有显著性(表1, 图1, 图2和图3).

表1 GDF-15基因定量结果.

样本	GAPDH C t值	GDF-15 C t值	Ct	- ΔΔCt	2- ΔΔCt
对照组	14.68	22.78	8.10	0.075	1.053
对照组	14.69	22.94	8.25	-0.075	0.949
实验组	14.50	23.93	9.43	-1.255	0.419
实验组	14.56	24.21	9.65	-1.475	0.360

图1 GDF-15基因PCR扩增曲线.

图2 GDF-15基因结果统计图.

图3 GDF-15基因扩增产物熔解曲线.

2.2 GDF-15基因在胃腺癌及癌旁正常组织中的表达

GDF-15基因在胃腺癌组织中表达增强, 癌旁正常组织中表达较弱(图4), 40例胃腺癌标本, 阳性表达31例, 阳性表达率为77.5%, 40例癌旁正常组织阳性表达10例, 阳性表达率为25%, 二者表达差异具有显著性意义(P = 0.002, P<0.05).

图4 GDF-15表达(×400). A: 阴性; B: 阳性.

3 讨论

GDF-15是Baek等[11]于1997发现的转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的成员, GDF-15在不同肿瘤中表达不一致. Liu等[12]的研究表明GDF-15能在体外减少肿瘤细胞间的黏附, 在细胞癌变的不同阶段上调, 这与贺飞

等[13]与曹征等[14]的研究相似, 提示GDF-15在细胞癌变过程中起到重要作用. 然而, 在化生的支气管鳞状上皮癌或者肺癌中GDF-15蛋白则不表达, 而在正常的气管支气管上皮中表达[15]; 也有研究表明在肿瘤中GDF-15可以促进细胞凋亡, 抑制细胞生长, 说明他在某些情况下具有抑制肿瘤的作用[16]. GDF-15在各种肿瘤中表达与相应正常组织相比, 是升高还是降低, 目前各家研究意见不一, 至今没有得到很好的解释.

已有研究表明, 一定浓度TSA作用SGC-7901细胞后, 可诱导SGC-7901细胞凋亡[9], 为了研究GDF-15基因是否在一定浓度TSA作用SGC-7901细胞后表达发生变化, 我们采用Real-time PCR方法检测了TSA作用SGC-7901细胞前后GDF-15因子表达, 实验发现, 胃腺癌细胞系SGC-7901经一定剂量TSA作用后, GDF-15因子表达明显下调, 这提示GDF-15基因的变化在SGC-7901细胞凋亡的过程中可能发挥一定作用. TSA作用SGC-7901后, 可能通过抑制GDF-15因子的表达, 在一定程度上抑制了GDF-15因子的促癌作用, 使SGC-7901细胞发生凋亡. 随后我们研究了GDF-15因子在临床病例中的表达, 选取我科手术治疗的40例进展期胃腺癌病例标本进行了GDF-15因子的免疫组织化学检测, 结果表明GDF-15基因在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常胃组织, 这进一步提示我们GDF-15基因在胃腺癌的发生发展中可能发挥作用. 一般认为GDF-15的促癌作用可能与以下3个机制相关: (1)抑制连环蛋白cateninδ1基因的表达[12]; (2)通过ERK1/2通路上调UPA系统增强癌细胞的侵袭性[8,17]; (3)诱导ErbB2受体酪氨酸激酶在人体癌细胞中过度表达[5]. GDF-15基因是否通过以上三个途径的功能受到抑制, 发挥诱导SGC-7901细胞凋亡还值得进一步研究.

实验表明, GDF-15基因在进展期胃癌组织中表达增强, 在胃癌细胞SGC-7901经一定浓度TSA作用后表达受到抑制, 可能促进了SGC-7901细胞凋亡, 但其具体机制还未明确, 仍待研究, 以进一步揭示胃癌的发生发展.

评论

背景资料

中国胃癌患者的病死率居于各种恶性肿瘤之首, 相关研究尤为重要. 生长分化因子-15(growth differentiation factor-15, GDF-l5)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族成员之一, 可导致肿瘤的发生, 也可抑制肿瘤的发生. 研究胃癌与GDF-15的关系, 有利于提高对胃癌机制的认识.

同行评议者

高泽立, 副教授, 上海交大医学院九院周浦分院

研发前沿

曲古菌素A可促进胃癌细胞的凋亡, 也可导致胃癌细胞基因表达的变化, 关于曲古菌素A作用后胃癌细胞GDF-15基因表达的研究国内外未见报道, GDF-15与胃癌关系的研究也是热点之一.

相关报道

GDF-15在多种肿瘤中发挥作用, 在黑素瘤, 结肠癌, 胰腺癌, 前列腺癌, 乳腺癌, 头颈鳞癌中均可见表达水平增高的报道. 但在胃癌研究中GDF-15研究较少, 目前将胃癌细胞系SGC-7901与临床胃癌病例结合研究GDF-15未见报道.

创新盘点

本文首次采用Real-time方法检测了曲古菌素A作用胃癌细胞系SGC-7901后GDF-15基因的表达情况, 并与临床进展期胃腺癌患者中GDF-15表达研究相结合, 创新意识强.

同行评价

本文选题紧扣当前消化系肿瘤防治研究热点, 实验设计合理, 实验数据结果可靠, 统计方法得当. 参考文献较新, 值得广大临床及基础研究者阅读.

备注

编辑 田滢 电编 鲁亚静

参考文献

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