修回日期: 2013-01-20
接受日期: 2013-02-01
在线出版日期: 2013-02-28
肝硬化是严重威胁人类健康的疾病之一, 目前尚无一种能够普遍开展的有效阻断该疾病进程的根治措施. 干细胞领域的研究进展为肝硬化的治疗带来了契机. 具有来源广泛、免疫原性弱、增殖分化能力强等优势的人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)已在相关的基础及临床研究报道中展现出诱人临床应用价值. 本文就脐血MSCs的生物学特性及其在治疗肝硬化方面的应用研究作一综述.
引文著录: 廖金卯, 胡小宣. 脐血间充质干细胞移植治疗肝硬化的研究进展. 世界华人消化杂志 2013; 21(6): 508-513
Revised: January 20, 2013
Accepted: February 1, 2013
Published online: February 28, 2013
Cirrhosis is a serious threat to human health. Currently, there have been no available radical measures that can effectively block the process of this disease. The research progress in the field of stem cells brings an opportunity for the treatment of cirrhosis. Having a wide variety of sources, weak immunogenicity, and strong proliferation and differentiation ability, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells have been demonstrated to be promising in the treatment of liver cirrhosis. This article reviews the biological characteristics of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells and their application in the treatment of cirrhosis.
- Citation: Liao JM, Hu XX. Transplantation of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells for treatment of liver cirrhosis: Research progress. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2013; 21(6): 508-513
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v21/i6/508.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v21.i6.508
肝硬化是各种慢性肝病发展的终末期表现, 以肝纤维组织增生, 假小叶形成为典型特征, 此时正常的肝细胞大量受损破坏, 肝实质细胞数量减少, 当肝脏受到的损害超过其代偿功能时, 将导致肝其合成、储备、解毒、免疫等各项功能的严重不足, 随之产生一系列与之相应的临床症状和表现, 严重威胁人们的健康. 目前对于肝硬化尚缺乏有效的治疗措施, 肝移植由于种种条件的限制, 阻碍了其在临床的广泛开展. 寻求和探索一种新的肝硬化治疗技术成为了人们努力的方向. 干细胞领域的研究探索, 使具有来源广泛、免疫原性弱、增殖分化能力强等优势的脐血MSCs在治疗终末期肝病方面, 展现出诱人的临床应用价值, 有望为相关终末期肝病的治疗带来突破[1-5].
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是机体内存在的一类具有自我增殖和多向分化潜能[6-9]的多能干细胞. 大量研究表明MSCs 能向各个胚层来源的多种细胞分化, 具有强大的可塑性. 在一定的微环境中MSCs可被诱导分化为肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等[10-18], 在组织工程、基因工程以及临床应用上有着很大的应用价值. 目前科研工作者已经在骨髓[19]、脂肪[20]、皮肤[21]、脑[22]等许多组织中分离出了MSCs, 且普遍认为骨髓是其最主要的来源. 然而骨髓的采集是有创性操作, 会给取材者带来痛苦, 且所采集的MSCs的增殖能力、数量与供者的年龄及身体条件等相关. 自2000年Erices等[23]首次从人类脐血中分离出MSCs以后, 人们发现脐血MSCs与其他来源的MSCs相比具有来源广、采集方便、取材无痛苦、免疫原性低、更原始、增值分化能力更强以及不涉及伦理问题等优点.
MSCs在形态上类似成纤维细胞, 呈梭行平行排列或漩涡样生长, 其核浆比值大, 核仁明显. 目前研究认为, 脐血MSCs具有多种细胞表面抗原, 但无特异性的表面抗原特征, 据已有的报道, 迟作华等[24]总结了脐血MSCs表达的主要分子, 包括: (1)黏附分子: 如CD13、CD44、CD51、CD54等; (2)整合素家族: 如CD29、CD49b、CD49e等; (3)其他: 如CD90、CD105、HLA-ABG、ASMA、CD73等. 但不表达CD34、CD45、CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD38、CD117、CD133、CD135等造血谱系的细胞标记, 也不表达B7-1、B7-2及HLA-DR抗原等. 目前主要通过观察细胞形态, 检测免疫表型以及观察其多向分化功能等对其进行鉴定[25,26].
目前脐血MSCs的分离方法主要有密度梯度离心、羟乙基淀粉沉降法、单克隆抗体流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法等. 羟乙基淀粉沉降法, 存在细胞回收率低、所需时间较长, 操作复杂等不足; 单克隆抗体流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法通过识别不同的细胞表面分子标记而分选细胞, 所分离细胞的纯度和活力均较高, 但由于所需费用较多, 而限制了在实验研究中广泛应用; 密度梯度离心法: 此方法最初从脐带血中分离出的是单个核细胞层, 需要再依据MSCs体外培养贴壁生长的特性, 使用细胞贴壁筛选法将其从单个核细胞中分离出来. 此法简单有效, 节省时间, 成本低, 对细胞的损伤小, 且能较好的保持细胞活性, 但最初成分相对复杂、纯度不高, 需进行后续的细胞培养纯化[27].
人脐血MSCs的培养目前还没有形成统一确定的培养条件, 存在多种因素影响细胞的分离和培养, 如胎龄、收集的脐带血量、单个核细胞数、脐血分离时间、接种的细胞密度、传代和换液的时间以及培养基的选择等. DMEM低糖培养基联合胎牛血清是目前常用的培养条件. 但是研究认为, 在某些情况下胎牛血清促MSCs分化的作用要强于促进其增殖的作用, 因此在以细胞扩增为目的的培养时, 选择低血清或无血清培养基可能更适宜[28]. Bieback等[29]研究表明, 从脐血中提取MSCs需要注意: 收集的脐血应尽早进行处理, 以不超过15 h为宜; 每份脐血量不能少于33 mL; 脐血中所含单个核细胞的数不能少于1×108. 此外, Campagnoli等[30]指出, 相比足月儿, 在早产儿的脐血中所含的MSCs可能更原始, 有更强的增殖分化能力, 脐血中MSCs数量也会随着妊娠时间的延长而逐渐减少. 因此, 早期报道脐血中分离不出MSCs可能与此相关.
正常情况下, 肝脏的各种细胞和细胞外基质有着精确的比例和特定的空间结构, 通过各种细胞因子的信号调控, 而维持一个相对稳定的微环境. 肝脏受损后, 典型的修复过程涉及两个时期: 一个是再生期, 新生的肝细胞替代受损肝细胞发挥作用. 新生肝细胞来源包括: (1)成熟肝细胞, 通过有限的有丝分裂补充肝细胞的数量, 其增殖能力及修复作用有限; (2)肝前体细胞, 其分类上属于专能干细胞的一种, 肝脏受损时可定向增殖分化为肝细胞或胆管上皮细胞参与肝脏修复, 能起到一定的代偿修复作用, 但肝内的所含数量有限, 在增殖分化能力上可能弱于多能干细胞; (3)非肝源性多能干细胞, 如脐血MSCs、骨髓MSCs等, 此类细胞具有强大的增殖分化能力, 数量有限但在肝损害的微环境下可以增殖分化出较多的肝细胞, 因此是理想的肝脏修复原料[31]. 另一个则是纤维组织增生期, 该阶段纤维结缔组织代替了肝正常的实质组织. 肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是形成肝纤维化的最主要细胞, 在肝脏受到刺激而被激活时, 一系列细胞因子、生长因子、趋化因子均参与到了纤维化形成的过程中, 如IL-13、IL-21、MMPs、TIMPs、TGF-β1、PDGF、VEGF等[32], 使得细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成增加, 胶原合成过多, 此外, 肝Kupffer细胞和肝细胞自身亦有合成胶原的功能. 这些代偿尽管初期是有益的, 但若持续进行, 修复过程会导致ECM的过度积累, 而最终导致肝硬化和肝衰竭[33].
移植途径的选择可能会直接影响到移植细胞的归巢定植量, 进而影响治疗效果. 临床上细胞的移植途径主要包括经股动脉介入移植、门静脉移植、肝内移植、脾内移植、外周静脉移植、腹膜腔移植等.
3.2.1 经股动脉介入移植: 在X线监视下, 股动脉穿刺插管至肝动脉, 将制备好的脐血MSCs沿导管从肝动脉缓慢注入. 由于介入技术广泛开展, 此种方法操作熟练, 在临床上开展也较多.
3.2.2 门静脉移植: 门静脉血液中含有丰富的促进细胞生长的营养成分, 移植的细胞经血流到达肝血窦后, 可缓慢向肝索迁移, 并在肝脏损伤所释放的细胞因子诱导下在肝内定植, 重复的门静脉移植可增加细胞在肝内定植数, 起到更好的治疗效果, 相比外周血更具有优势[34]. 但门静脉移植时具有出血倾向, 受到凝血功能的限制, 且肝硬化时如果门脉压显著增高, 移植的细胞可随侧支循环较多分散到其他部位.
3.2.3 肝内移植: 此方法也是进行干细胞移植的治疗途径之一, 但由于具有出血倾向, 以及移植的细胞可能直接进入中央静脉而使产生肺栓塞的风险增加, 故临床上很少开展.
3.2.4 脾内移植: 可减少因肝脏微环境严重破坏, 而导致的移植细胞不易存活; 可降低因门静脉直接注射而导致的栓塞的风险, 但脾内定植的细胞多呈结节样生长, 且对于肝脏损伤的确切疗效尚不明确.
3.2.5 外周静脉移植: 此方法移植的细胞是否会因在全身的分散定植而增加致瘤性, 是否会由于肺脏的滤筛等而导致最终归巢细胞数量不足, 以及能否最终发挥治疗的效果, 仍没有确切定论.
3.2.6 腹膜腔移植: 腹腔移植简单, 但所需细胞量大, 可能导致腹腔内粘连, 移植的细胞难直接进入受损肝脏, 疗效待考证, 且在腹腔内所处环境存活时间不长.
3.3.1 基础研究: 间充质干细胞作为一种具有横向分化能力的多能干细胞, 近年来大量研究表明在合适的培养条件下其在体内外均可以向肝细胞分化. 2000年, 日本学者Oh等[35]使用大鼠骨髓干细胞, 加入不同浓度的HGF进行体外诱导培养之后检测到了鼠源性CK18、CK8、AFP等肝细胞特异性标志, 发现了骨髓干细胞可以分化为肝样细胞; 2002年, Danet等[2]经过体外实验证实脐血干细胞也是可以向肝细胞分化的, 随后Hong等[3]提出了同样的观点. 任红英等[36]通过实验指出, 脐血MSCs不仅可以在体外分化为有功能的肝样细胞, 而且证实了其免疫原性低. 2003年, Kakinuma等[37]通过报道指出, 脐血MSCs在体外和体内均可诱导成为肝样细胞. Beerheide等[38]将从脐带血中分离的MSCs荧光标记后移植到严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency disease, SCID)大鼠的肝脏内, 移植后1 wk检测发现移植的细胞已整合到SCID鼠的肝脏组织里面, 并检出了人源性的白蛋白的表达. Tang等[39]还通过脐血干细胞移植的动物实验指出, 移植的脐带血干细胞不仅对老鼠的重型肝炎具有疗效, 而且对合并的心肌损伤也有治疗作用.
目前对于移植的MSCs发挥治疗作用的具体机制还不是很明确. 部分研究认为脐血MSCs产生治疗作用的机制可能包括: (1)直接分化: 在肝脏微环境的影响下定植, 增殖, 并分化成为肝细胞, 发挥作用, 改善肝功能; (2)旁分泌途径: 在肝损伤环境中MSCs可以分泌不同水平的细胞因子相互影响, 表现出抗炎症反应的作用, 并可能激活肝内的肝干细胞, 促进肝细胞再生[40]; (3)细胞融合: MSCs可能直接与肝细胞融合, 进而启动细胞的增殖过程; (4)抑制产生细胞外基质的HSC的活化, 有研究表明在体外HSC的增殖活性受会到MSCs的明显抑制[41]; (5)直接降解肝内过量沉积的ECM, 减轻肝纤维化. Yamamoto等[42]通过实验证明MSCs通过高表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)而降解ECM, 逆转肝纤维化; (6)激活受损肝细胞, 在一定程度上启动内源性肝细胞增殖过程等. 基础研究的开展给脐血干细胞的临床应用提供了理论指导.
3.3.2 临床应用研究: 脐血干细胞移植在肝病治疗方面的临床研究证实, 经干细胞治疗后的患者, 其临床一般情况好转, 肝功能改善. 胡小宣等[43]统计了34例失代偿期肝硬化患者经脐血干细胞移植治疗后的效果, 术后1 mo, 32例患者食欲改善, 29例患者体力好转, 28例腹胀减轻. 25例并发腹水患者术后1 mo, 15例腹水明显减少, 9例腹水消失. 术后6 mo血清白蛋白(albumin, ALB)逐渐升高, 由30.9 g/L±0.6 g/L升至35.5 g/L±2.5 g/L; 丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)由57 U/L±7 U/L降至46 U/L±10 U/L; 总胆红素由47 μmol/L±5 μmol/L下降至25 μmol/L±4 μmol/L; 凝血酶原时间由(17.9±0.7)降至(16.4±1.3); 术后未发现严重不良反应, 提示脐血干细胞移植安全可行, 可不同程度改善肝功能. Zhang等[44]统计20例肝硬化失代偿期患者脐血干细胞移植的临床疗效, 患者腹腔积液减少率为75%, 乏力好转率为80%, 肝病面容、肝掌及蜘蛛痣减轻率为70%. 乔飞等[45]、杨宏丽等[46]采用脐血干细胞移植治疗肝硬化也均取得了一定疗效. 上述研究报道虽然存在纳入病例数较少, 暂无法长期追踪观察进行疗效评价等局限性, 但是初步临床疗效是积极肯定的, 这均表明脐血间充质干细胞移植不失为治疗肝硬化、终末期肝病的另一种有效治疗选择.
安全性是细胞移植治疗应用于临床前需要特别关注的问题, 目前对于安全性的探讨包括多个方面: 如: (1)血栓性微血管病(thrombotic microangiopathies, TMA): 是指以病理表现为微血管内皮损伤、官腔狭窄和微血栓形成的一组疾病, 严重的可导致多器官功能衰竭, 病死率高[47]. 在干细胞移植的过程中, 由于细胞的体外分离、培养, 原始的一些生物学特性可能受到干预, 细胞移植后可能在各种细胞因子的作用下而导致血管内内皮细胞的损害, 诱发TMA[48]; (2)免疫排异: 目前认为脐血MSCs作为一种较原始细胞, 不表达MHCⅡ类分子, 低表达或不表达MHCⅠ类分子, 免疫源性很低, 可逃脱宿主的免疫排斥反应, 并有可能成为同种异体细胞移植的来源; (3)致瘤作用: 这是细胞移植治疗后的一个很重要的问题, 也是近年来研究者所关注的, 在肿瘤起源学说中有人指出"肿瘤细胞的产生可能最初来源于异常分化的干细胞"[49]. 原始的MSCs在整个体内的含量都较少, 一份脐血所能直接提取的MSCs有限, 需要通体外的适当扩增才能满足移植的需求, 然而, 在离开自身脐血环境下的分离培养、传代扩增等, 都会对细胞产生一定的影响, 随着时间的延长, 损伤可能导致细胞染色体结构的变化, 当最后累积的损伤到达一定程度时而导致有害基因突变. Kunkel等[50]指出, 在细胞过程中, 每一次分裂就有一次基因突变的可能. 遗传性状的改变最终可能使移植的干细胞出现意想不到的分化, 甚至瘤样分化.
脐血MSCs自身的独特优势和其在基础及临床上的研究进展, 使之在治疗肝硬化方面显示出了诱人的临床应用前景. 然而在此技术成熟的开展前所亟待解决的问题也还有很多: (1)MSCs经提取后是进行直接体内移植还是体外培养较纯化后进行移植? (2)MSCs提取的最佳方式、体外培养的最适应环境, 能否达成统一的执行标准? (3)移植的最佳细胞数目, 移植的最佳时间、反复移植的疗效评价标准? (4)移植细胞的归巢定植的具体机制? (5)移植细胞发挥治疗作用的具体机制? (6)远期安全性的评价? 是否会具有致瘤作用? 等都是需要继续努力的方向. 为使脐血MSCs作为种子细胞, 在临床终末期肝病的治疗道路上发挥决定性作用, 不断的研究和探索工作任重而道远.
肝硬化的基础内科治疗不理想, 人脐血间充质干细胞移植作为近年来开展起来的一种全新的治疗手段, 为肝硬化患者的治疗带来希望.
徐泱, 副主任医师, 上海复旦大学附属中山医院
在治疗肝硬化方面, 脐血间充质干细胞发挥治疗作用的机制是目前研究的热点, 其远期安全性需进一步探讨.
国内利用脐血干细胞移植治疗肝硬化的基础及临床研究正相继开展, 胡小宣等均证实采用脐血干细胞治疗肝硬化患者可以取得一定的疗效.
国内外脐血间充质干细胞移植治疗肝硬化取得了很大进展, 但诸多问题仍亟待解决.
间充质干细胞: 干细胞家族的重要成员, 来源于发育早期的中胚层和外胚层, 是可形成多种细胞类型的多能干细胞, 但不具备发育为完整个体的能力.
本文综述了脐血MSCs移植治疗肝硬化的进展, 具有较好的参考价值; 文章内容较为全面, 基本涵盖脐血MSCs机制、临床等方面的研究进展.
编辑: 李军亮 电编: 闫晋利
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