ALDH1A2、MMP2和E-cadherin在结肠癌组织中的表达及相关性

摘要

目的: 研究结肠癌组织中ALDH1A2、E-cadherin和MMP2的表达及与临床病理特征之间的关系.

方法: 应用免疫组织化学SP法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western blot)检测52例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、E-cadherin和MMP2蛋白的表达, 分析其间的相关性以及与肿瘤临床病理特征之间的关系.

结果: 免疫组织化学测定显示ALDH1A2在52例结肠癌癌旁组织阳性率为67.31%; E-cadherin在52例结肠癌癌旁阳性率为90.38%; 癌旁组织ALDH1A2、E-cadherin的表达率高于癌组织. MMP2在52例结肠癌组织中阳性率占86.54%, 高于癌旁组织(P<0.05). 逆转录-PCR及免疫印迹技术显示同样结果. ALDH1A2、MMP2及E-cadherin在结肠癌中的表达具有相关性.

结论: 结肠癌中ALDH1A2、E-cadherin表达低于癌旁组织, MMP2表达高于癌旁组织, ALDH1A2、MMP2及E-cadherin三者密切相关.

关键词: ALDH1A2; 金属基质蛋白酶2; 上皮钙黏蛋白; 结肠癌

Significance of ALDH1A2, MMP2 and E-cadherin expression in colonic cancer

Wan-Guang Yang, Wan-Peng Wang, Xie-Fu Zhang

Wan-Guang Yang, Wan-Peng Wang, Department of Emergency Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Xie-Fu Zhang, Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Correspondence to: Xie-Fu Zhang, Professor, Chief Physician, Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 1 Jianshe East Road, Zhengzhou 450052, Henan Province, China. kfywg@eyou.com

Received: December 8, 2012
Revised: January 7, 2013
Accepted: January 18, 2013
Published online: February 8, 2013

Abstract

AIM: To investigate the expression of ALDH1A2, E-cadherin and MMP2 in colonic cancer and to analyze their clinical significance.

METHODS: RT-PCR, Western blot and immunohistochemistry were used to examine the expression and distribution of ALDH1A2, E-cadherin and MMP2 in 52 surgically resected specimens of colonic cancer and matched tumor-adjacent colonic mucosal tissue. The correlations among them and their relationship to the clinicopathologic characteristics of colonic cancer were analyzed.

RESULTS: The positive rates of ALDH1A2 and E-cadherin in tumor-adjacent colonic mucosal tissue were 67.31% and 90.38%, respectively, which were significantly higher than that in colonic cancer tissue. The positive rate of MMP2 in colonic cancer was 86.54%, significantly higher than that in tumor-adjacent colonic mucosal (P < 0.05). RT-PCR and Western blot analyses revealed similar results. There were significant correlations among ALDH1A2, MMP2 and E-cadherin expression in colorectal carcinoma.

CONCLUSION: Expression of ALDH1A2 and E-cadherin in colonic cancer is lower than in tumor-adjacent colonic mucosal tissue, while MMP2 expression in colonic cancer is higher than that in tumor-adjacent colonic mucosal tissue. ALDH1A2 expression was correlated with MMP2 and E-cadherin expression in colonic cancer.

Key Words: ALDH1A2; MMP2; E-cadherin; Colonic cancer

0 引言

ALDH1A2是乙醛脱氢酶家族中17个基因之一, 乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH1)是负责各种细胞内醛氧化羧酸的细胞质酶[1]. 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)s是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶, 在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润转移中起重要作用. 上皮钙黏蛋白(E-cadherin)是介导上皮细胞间黏附的主要黏附分子, 主要介导同质性细胞黏附. 本研究中, 我们利用免疫组织化学、RT-PCR法及免疫印迹技术测定ALDH1A2、MMP2和E-cadherin在人结肠癌及癌旁组织中mRNA及蛋白的表达, 探讨其与结肠癌病理分期的相关性.

1 材料和方法

1.1 材料

ALDH1A2、MMP2和E-cadherin抗体购自Santa cruz公司; 免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 逆转录和PCR扩增试剂盒均购自北京全式金生物公司. 病理标本来自2008-2009我院病理科存档52例结肠癌术后的石蜡标本, 男、女各半, 经病理诊断证实, 并且术前未经化疗、放疗, 术后均给予以化疗为主的综合治疗, 并有完整的随访资料. 组织标本从2009-09/2010-04在我院手术治疗, 且经病理诊断为结肠癌的患者中选取.

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法: 免疫组织化学SP染色按说明书进行, 采用双评分半定量积分法, 对ALDH1A2、MMP2和E-cadherin的IHC结果进行分析. 以出现棕黄色或棕色颗粒的细胞作为阳性细胞, ALDH1A2、MMP2阳性部位在细胞浆, E-cadherin的阳性部位在胞膜, 部分细胞浆也呈阳性.

1.2.2 逆转录-PCR法测定结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin mRNA的表达: 采用用TRIzol提取组织中mRNA; 反转录成cDNA, 反应条件为离心、混匀后42 ℃孵育30 min, 然后85 ℃加热5 min用来灭活逆转录酶. 取2 µL进行后续扩增, 其余-84 ℃保存. PCR扩增目的基因(ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin); 扩增结束后, 产物经1.5%(w/v)琼脂糖凝胶溶液电泳, 当溴酚蓝电泳至适当位置, 在紫外灯下观察结果和拍照.

1.2.3 Western blot检测组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin蛋白的表达: 组织标本冰上匀浆充分裂解, 取20 μg蛋白样品于10%SDS-PAGE电泳分离并转膜. 膜在室温下封闭1 h, 4 ℃一抗孵育过夜. 辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育1 h. ECL试剂检测蛋白条带. 将胶片扫描后用Bandscan5.0软件进行灰度分析.

统计学处理 所有数据采用mean±SD表示, 多均数的比较采用方差分析. P<0.05表示有统计学意义.

2 结果

2.1 免疫组织化学测定ALDH1A2、MMP2和E-cadherin在结肠癌及癌旁组织中的表达

ALDH1A2、MMP2表达于细胞胞浆, 呈淡黄至棕黄、棕褐色. ALDH1A2在52例结肠癌癌旁中35例阳性表达, 17例阴性表达, 阳性率占67.31%. MMP2在52例结肠癌组织中45例阳性表达, 7例阴性表达, 阳性率占86.54%. E-cadherin表达于细胞胞膜/浆, 呈淡黄至棕黄、棕褐色. E-cadherin在52例结肠癌癌旁中47例阳性表达, 5例阴性表达, 阳性率占90.38%. 差异均有统计学意义(表1). RT-PCR测定结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin mRNA的表达: RT-PCR结果显示ALDH1A2 mRNA含量在癌旁组织中高于结肠癌; MMP2 mRNA含量在癌组织中高于癌旁组织; E-cadherin mRNA含量在癌旁组织中高于结肠癌, 差异均有统计学意义(P<0.05, 表2, 图1). Western blot测定结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin蛋白的表达: 免疫印迹结果显示ALDH1A2蛋白含量在癌旁组织中高于结肠癌; MMP2蛋白含量在癌组织中高于癌旁组织; E-cadherin蛋白含量在癌旁组织中高于结肠癌, 差异均有统计学意义(P<0.05, 表5, 图2).

表1 ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin在结肠癌及癌旁组织中的表达 (n = 52).

分组	阴性	阳性			阳性率(%)	χ2值	P值
	(-)	(+)	(++)	(+++)
ALDH1A2
结肠癌组织	32	13	6	1	38.46	5.34	<0.05
癌旁组织	17	13	10	12	67.31
E-cadherin
结肠癌组织	37	11	3	1	28.85	9.47	<0.05
癌旁组织	5	17	22	8	90.38
MMP2表达强度
结肠癌组织	7	7	25	13	86.54	7.19	<0.05
癌旁组织	35	10	5	2	32.69

图1 结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin mRNA的表达.

表2 结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin mRNA及蛋白的表达 (mean±SD).

	ALDH1A2	MMP2	E-cadherin
RT-PCR
结肠癌	0.136±0.021	0.529±0.063	0.159±0.022
癌旁组织	0.675±0.074a	0.172±0.024a	0.572±0.077a
Wb
结肠癌	0.094±0.013	0.634±0.068	0.115±0.014
癌旁组织	0.528±0.065a	0.325±0.043a	0.483±0.068a

^aP<0.05 vs 结肠癌组织.

图2 结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP-2、E-cadherin的表达.

2.2 ALDH1A2、MMP2和E-cadherin在大肠癌组织中表达的相关性

ALDH1A2、MMP2和E-cadherin在大肠癌组织中表达的相互关系分别见表3-5. 表中显示的相互关系三者具有密切相关性(P<0.05).

表3 ALDH1A2与MMP2在结肠癌组织中表达的相互关系 (n).

ALDH1A2	MMP-2		Kappa	P值
	阳性	阴性
阳性	14	6	0.532	<0.05
阴性	31	1

表4 ALDH1A2与E-cadherin在结肠癌组织中表达的相互关系 (n).

ALDH1A2	E-cadherin		Kappa	P值
	阳性	阴性
阳性	12	8	0.532	<0.05
阴性	3	29

表5 MMP2与E-cadherin在结肠癌组织中表达的相互关系 (n).

ALDH1A2	MMP-2		Kappa	P值
	阳性	阴性
阳性	13	32	0.646	<0.05
阴性	2	5

3 讨论

结肠癌患者5年生存率近十年来徘徊在50%左右. 在西方国家进展也差别不大[1]. 日本结肠癌术后5年生存率60年代是45%, 到80年代上升的78%[2]. ALDH是负责各种细胞内醛氧化羧酸的细胞质酶[3]. 到目前为止, 已经发现17种ALDH的亚型. 2010年宾夕法尼亚大学Deng等[4]发现, ALDH1在正常人体组织的表达和分布差异显著. 正常组织细胞中, 维生素A代谢的中间产物为视黄醛, ALDH1A2不可逆氧化视黄醛为维甲酸[5]. ALDHlA2是催化视黄醛的氧化成维甲酸的关键酶[6], 维甲酸正常的生理浓度很低, 与维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)和维甲酸X受体(retinoic X receptora, RXR)通过配体结合区域结合, 直接作用于靶基因, 调节不同靶基因的表达, 进而调控正常和肿瘤细胞的生长和分化[7-9]. Dahiya等[10]发现ALDH1A2催化生成的维甲酸具有抑制肿瘤细胞生长、增殖、侵袭转移及黏附的作用. RA使胃癌细胞株MKN45H对基底膜胶(Matrigel)的黏附能力下降, 明胶酶的分泌能力降低[11,12], 也有研究证明该基因可能参与癌细胞增殖的负性调控[13]. 本研究发现, 在结肠癌旁组织中, ALDH1A2表达于细胞胞浆, 并证明癌旁组织中ALDH1A2酶高表达, 而结肠癌组织中低表达. 这一结果证实ALDH1A2与结肠癌的生物学行为相关.

肿瘤转移的前提是突破原位基底膜屏障迁移入血或远处器官, 黏附是肿瘤迁徙和转移的始动因素[14]. 而MMP在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润、转移中起重要作用. 本研究中结果表明: MMP2表达于细胞胞浆, MMP2蛋白在癌组织远高于癌旁组织. 这一结果证实了MMP2蛋白可能影响了结肠癌的生物学行为. 本研究还证实E-cadherin在癌组织中表达高于对照组织, 这一结果也与国内的研究结果一致[15], 表明E-cadherin表达减弱是肿瘤细胞低分化的重要因素.

我们对ALDH1A2、MMP2及E-cadherin在结肠癌中的表达进行了相关系分析, 结果显示ALDH1A2与MMP2及E-cadherin具有密切的相关性. 我们可以设想ALDH1A2在癌组织中的低表达可能导致ATRA合成的减少, 进而通过MMP2的高表达来水解结肠癌细胞浸润扩散过程中的一道天然屏障-基底膜, 导致结肠癌细胞侵袭转移能力大大加强, 同时结肠癌中E-cadherin的低表达, 细胞间黏附力下降, 肿瘤细胞易于从肿瘤团块上脱落下来, 进入浸润转移进程, 为我们进一步的研究奠定了基础.

评论

背景资料

研究结果显示: ALDH1与肿瘤的发生、发展密切相关. ALDHlA2是催化视黄醛氧化成维甲酸的关键酶, 维甲酸与维甲酸受体(RAR)以及维甲酸X受体(RXR)通过配体结合区域结合, 直接作用于靶基因, 调节不同靶基因的表达, 进而调控正常和肿瘤细胞的生长和分化.

同行评议者

黄缘, 教授, 南昌大学第二附属医院消化内科, 江西省分子医学重点实验室

研发前沿

本文最先利用免疫组织化学技术、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定人结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin mRNA及蛋白的表达情况, 探讨ALDH1A2在体内对结肠癌的影响, 以期找到ALDH1A2在结肠癌中的作用机制.

相关报道

Dahiya发现13-cisRA除了能抑制人前列腺癌细胞株LNCaP生长、使其裸鼠致瘤性及软琼脂克隆形成能力下降外, 还能使Ⅳ型胶原酶的活性下降50%. RA使胃癌细胞株MKN45H对基底膜胶(Matrigel)的黏附能力下降, 明胶酶的分泌能力降低. 以上研究显示ALDH1A2催化生成的维甲酸具有抑制肿瘤细胞生长、增殖、侵袭转移及黏附的作用.

创新盘点

经检索查新发现国内有ALDH1A2基因影响膀胱癌细胞株的生物学行为研究, 但均未涉及ALDH1A2基因在结肠癌组织中的表达. 通过本研究结果, 可以设想ALDH1A2在癌组织中的低表达可能导致ATRA合成的减少, 进而影响到MMP2及E-cadherin的表达, 通过上调MMP2的表达来水解结肠癌细胞浸润扩散过程中的一道天然屏障-基底膜, 导致结肠癌细胞侵袭转移能力大大加强, 同时下调结肠癌中E-cadherin的表达, 引起细胞间黏附力下降, 使结肠癌细胞易于从肿瘤团块上脱落下来, 进入浸润转移进程.

同行评价

本文实验设计科学、合理, 数据完整, 分析问题逻辑性强, 结合临床工作, 有一定的指导意义.

备注

编辑: 田滢 电编: 闫晋利

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