miR-126调控胃癌细胞VEGFA及其下游靶蛋白Akt、mTOR、Erk1/2的表达

摘要

目的: 本研究拟明确miR-126对胃癌细胞血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A, VEGFA)及其下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular regulated protein kinases, MAPK/Erk)两条信号通路上核心蛋白Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinprotein, mTOR)和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, Erk1/2)表达的调控作用, 从而来初步探讨miR-126影响胃癌细胞恶性表型的可能机制.

方法: 选取人胃腺癌细胞SGC-7901作为实验细胞, 分空白组(mock)、miR-126慢病毒实验组(Lenti-miR-126)、慢病毒对照组(Lenti-control)、miR-126寡核苷酸抑制组(locked nucleic acid anti miR-126 oligonucleotides group, LNA-miR-126)与寡核苷酸对照组(LNA-control)共5组. 利用miR-126慢病毒和miR-126 LNA power inhibitor探针转染SGC-7901细胞系, 转染后72 h观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达情况, 感染效率>70%, 提取细胞总小RNA和总蛋白, 利用实时定量PCR检测miR-126的表达情况, 同时通过Western blot检测VEGFA及下游信号通路上核心蛋白Erk、Akt、mTOR的表达.

结果: Western blot显示miR-126慢病毒实验组的VEGFA及其下游靶蛋白Akt、mTOR、Erk1/2表达较空白组明显降低(1.00±0.00 vs 1.60±0.19, 1.00±0.00 vs 1.89±0.23, 1.00±0.00 vs 2.11±0.38, 1.00±0.00 vs 1.52±0.36, 均P<0.01), miR-126寡核苷酸抑制组的VEGFA及其下游靶蛋白Akt、mTOR、Erk1/2表达较空白组明显升高(2.46±0.31 vs 1.60±0.19, 3.09±0.44 vs 1.89±0.23, 3.83±0.64 vs 2.11±0.38, 2.26±0.30 vs 1.52±0.36, 均P<0.01).

结论: miR-126可调控胃癌细胞VEGFA及其下游靶蛋白的表达, 胃癌中可能存在miR-126/VEGFA信号通路调控胃癌的血管新生.

关键词: miR-126; 血管内皮生长因子A; 胃癌血管新生

核心提示: 本文探讨了miR-126对胃癌细胞血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A, VEGFA)及其下游靶蛋白的调控作用, 同时结合大量的前人研究及本课题组前期的研究, 初步推测胃癌中可能存在miR-126/VEGFA信号通路调控胃癌的血管新生.

MiR-126 regulates the expression of vascular endothelial growth factor A and its downstream target proteins Akt, mTOR and Erk1/2 in gastric cancer cells

Yu-Peng Lei, Hong-Xia Chen, Xiao-Dong Zhou

Yu-Peng Lei, Xiao-Dong Zhou, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Hong-Xia Chen, Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81160307.

Correspondence to: Xiao-Dong Zhou, Associate Professor, Associate Chief Physician, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, 17 Yongwaizheng Street, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. yfyzxd@163.com

Received: September 15, 2013
Revised: November 6, 2013
Accepted: November 25, 2013
Published online: December 28, 2013

Abstract

AIM: To determine the regulatory effect of miR-126 on expression of vascular endothelial growth factor A (VEGFA)and its downstream proteins including protein kinase B (Akt), mammalian target of rapamycin protein (mTOR) and extracellular regulated protein kinases (Erk1/2) in gastric cancer cells.

METHODS: Recombinant lentivirus LV-miR-126 and miRCURY LNA™ miR-126 inhibitor were used to up-regulate or down-regulate the miR-126 expression in SGC-7901 cells. The cells were divided into a mock group, a lenti-miR-126 group, a lenti-control group, a locked nucleic acid (LNA)-antimiR-126 oligonucleotides group and a LNA-control group. Real-time PCR was used to confirm the relative expression of miR-126, and Western blot was used to detect the expression levels of Akt, mTOR, Erk and VEGFA proteins in different groups.

RESULTS: Western blot analysis demonstrated that the expression of VEGFA and its downstream proteins Akt, mTOR and Erk1/2 was significantly decreased in the lenti-miR-126 group than in the mock group (1.00 ± 0.00 vs 1.60 ± 0.19, 1.00 ± 0.00 vs 1.89 ± 0.23, 1.00 ± 0.00 vs 2.11 ± 0.38, 1.00 ± 0.00 vs 1.52 ± 0.36, all P < 0.01). In contrast, the expression of VEGFA and its downstream proteins Akt, Erk1/2 and mTOR was significantly increased in the LNA-miR-126 group than in the mock group (2.46 ± 0.31 vs 1.60 ± 0.19, 3.09 ± 0.44 vs 1.89 ± 0.23, 3.83 ± 0.64 vs 2.11 ± 0.38, 2.26 ± 0.30 vs 1.52 ± 0.36, all P < 0.01).

CONCLUSION: Our results indicate that miR-126 could regulate the expression of VEGFA and its downstream proteins Akt, Erk1/2 and mTOR. These findings suggest that there may be a miR-126/VEGFA signaling pathway regulating angiogenesis in gastric cancer.

Key Words: MiR-126; Vascular endothelial growth factor-A; Gastric cancer; Angiogenesis

0 引言

胃癌的发病率和死亡率居我国恶性肿瘤之首, 占胃恶性肿瘤的95%. 目前研究发现, 肿瘤血管的新生在胃癌的发生和发展中可能有重要的地位, 但尚未找到有效靶点. 大量的研究包括我们前期的研究发现, 胃癌(gastric cancer, GC)过高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR), 其过表达与胃癌的血管新生及恶性表型密切相关[1-5]. 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)是VEGF/VEGFR信号通路重要的下游靶蛋白, 经VEGF介导的MAPK/ERK和PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)两条信号通路在调节肿瘤细胞和内皮细胞的存活、稳定、增殖、迁移乃至血管新生中发挥着重要作用[6,7]. Feng等[8]研究发现, 与正常组织相比较, miR-126在胃癌组织中有着明显的低表达. 在SGC-7901胃癌细胞中miR-126的异位表达能够通过诱导细胞进入G₀/G₁期来抑制细胞的生长, 说明了在胃癌中miR-126扮演着抑制肿瘤的角色. miR-126在生理性血管生长中具有强大的调控功能, 他能否抑制肿瘤的血管新生仍不清楚. 故此, 我们提出: GC细胞下调表达miR-126与高表达VEGF/VEGFR可能存在某种负调控关联? 刘博等[9]通过生物信息学研究发现, miR-126和VEGF的3'端非编码区域(untranslated region, 3'UTR)存在互补序列, 并通过报告基因方法初步证明了miR-126可通过与VEGFA 3'UTR的互补而抑制VEGFA的翻译, 因此VEGFA可能是miR-126负调控的靶基因. 因此, 本课题将通过体外实验来诱导胃癌细胞miR-126过表达和miR-126低表达来观察VEGFA的变化及下游PI3K/Akt和MAPK/Erk两条信号通路上核心蛋白的表达变化, 以明确miR-126对GC细胞VEGFA的靶向调控作用及其对VEGFA下游关键信号通路的影响, 从而初步探讨胃癌细胞中miR-126的表达与胃癌血管新生的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

中分化的人胃腺癌细胞系SGC-7901为南昌大学第一附属医院消化研究所保存; 鼠抗人Akt、兔抗人mTOR和鼠抗人Erk1/2多克隆抗体购自Cell Signaling公司; 鼠抗人VEGFA多克隆抗体购自Abcam公司; has-miR-126慢病毒产品购自上海吉凯基因化学技术有限公司; miRCURY LNA Power inhibitor探针购自EXIQON公司; Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司; Small RNA提取试剂盒、cDNA逆录试剂盒及Real-time PCR反应试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 miR-126慢病毒转染SGC-7901细胞(miR-126慢病毒组): 细胞40%融合时, 将miR-126慢病毒感染SGC-7901细胞, 同时取空病毒载体实验作为阴性对照, 非感染细胞为空白对照. 感染12 h后观察细胞状态, 待48 h更换为正常培养基, 感染72 h观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况, 一般感染效率>70%即可进入后续实验.

1.2.2 miRCURY LNA Power inhibitor探针转染SGC-7901细胞(miR-126探针组): 细胞40%融合时, 将miR-126 LNA Power inhibitor探针转染SGC-7901细胞, 按Exiqon miRCURY^TM LNA Power inhibitor转染试剂盒操作说明, Lipofectamine 2000作为转染媒介, 取无关ir-antagomir转染作为对照, 非转染细胞为空白对照, 感染12 h后更换新鲜培养基, 感染72 h观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况, 一般感染效率>70%即可进入后续实验.

1.2.3 实时定量PCR检测miR-126表达: 采用实时定量PCR对5组细胞的miR-126进行检测, 操作按Small RNA提取试剂盒、cDNA逆录试剂盒及Real-time PCR反应试剂盒说明书进行.

1.2.4 Western blot蛋白印迹检测VEGFA及下游信号通路上核心蛋白Akt、mTOR、Erk的表达: 用冰PBS清洗细胞2次, 以去除死细胞和培养基, 用滤纸尽量吸干残余的PBS. 加入含蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的蛋白提取液400 μL, 反复在冰上摇匀, 使提取液与细胞充分接触30 min. 离心12000 r/min, 30 min, 回收并分装上清液, 分别提取5组细胞总蛋白. 以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照, 每个样本至少重复3遍, 取50 μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳, 并转至硝酸纤维膜上, 室温封闭2 h后, 用TBST缓冲液漂洗3次, 分别加入相应的一抗4 ℃孵育过夜, TBST漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1:2000), 室温摇床孵育2 h, 增强化学发光显色系统显色, 使用分子成像仪成像, 条带灰度值分析(图1).

图1 Western blot检测SGC-7901细胞蛋白的表达. 1: Lenti-miR-126: 2: Lenti-control; 3: LNA-miR-126; 4: LNA-control; 5: mock. mTOR: 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白; VEGFA: 血管内皮生长因子A; Akt: 蛋白激酶B; Erk1/2: 细胞外调节蛋白激酶.

1.2.5 图像分析: 采用美国Image Lab图像分析系统对Western blot印迹结果进行图像分析, 以miR-126慢病毒实验组设为参考条带, 计算各条带的相对灰度值.

统计学处理 实验数据由SPSS17.0统计软件处理, 计量资料用mean±SD表示. 应用Student's t检验、方差分析(ANOVA)对实验结果进行统计分析. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-126慢病毒和miR-126 LNA power inhibitor 探针转染胃癌细胞SGC-7901后miR-126的表达

实时定量PCR检测5组细胞miR-126的表达水平显示, miR-126慢病毒实验组的miR-126的表达是空白组的9.57倍(9.567±1.243 vs 1.000±0.000, P<0.01), 慢病毒对照组miR-126的表达与空白组无明显差异(P>0.05); miR-126探针组miR-126的表达明显低于空白组(0.037±0.012 vs 1.000±0.000, P<0.01), 寡核苷酸对照组miR-126的表达与空白组无明显差异(P>0.05)(表1).

表1 GC-7901各组细胞miR-126的表达情况目的/内参比 (n = 3, mean±SD).

分组	SGC-7901
Lenti-miR-126	9.57±1.24b
Lenti-control	1.63±0.46
LNA-miR-126	0.04±0.012b
LNA-control	1.17±0.25
mock	1.00±0.00

^bP<0.01 vs mock.

2.2 miR-126的表达与VEGFA的关系

SGC-7901细胞中, miR-126慢病毒实验组的VEGFA表达明显低于空白组(1.00±0.00 vs 1.60±0.19, P<0.01), miR-126探针组的VEGFA表达明显高于空白组(2.46±0.31 vs 1.60±0.19, P<0.01)(表2).

表2 SGC-7901各组细胞蛋白的表达情况目的/内参灰度比(n = 3, mean±SD).

分组	Akt	Erk1/2	VEGFA	mTOR
Lenti-miR-126	1.00±0.00b	1.00±0.00b	1.00±0.00b	1.00±0.00b
Lenti-control	1.59±0.20	1.50±0.32	1.52±0.28	2.08±0.16
LNA-miR-126	3.09±0.44b	2.26±0.30b	2.46±0.31b	3.83±0.64b
LNA-control	2.03±0.23	1.57±0.30	1.64±0.20	2.16±0.55
Mock	1.89±0.23	1.52±0.36	1.60±0.19	2.11±0.38

^bP<0.01 vs mock. VEGFA: 血管内皮生长因子A; Akt: 蛋白激酶B; Erk1/2: 细胞外调节蛋白激酶; mTOR: 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白.

2.3 miR-126的表达与Akt、mTOR、Erk1/2的关系

SGC-7901细胞中, miR-126慢病毒实验组的Akt、mTOR、Erk1/2表达明显低于空白组(1.00±0.00 vs 1.89±0.23, 1.00±0.00 vs 2.11±0.38, 1.00±0.00 vs 1.52±0.36, P<0.01), miR-126探针组的Akt、mTOR、Erk1/2表达明显高于空白组(3.09±0.44 vs 1.89±0.23, 3.83±0.64 vs 2.11±0.38, 2.26±0.30 vs 1.52±0.36, P<0.01)(表2).

3 讨论

miRNAs是一类长度在22 nt左右的内源性、非编码RNA基因产物, 通过与mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)互补结合而抑制翻译, 或通过与mRNA翻译区结合而直接引起mRNA的剪切, 从而负调控靶基因[10]. 前期本课题组综合运用miRNAs靶基因预测软件TargetScan和miRanda等对miR-126进行了分析和刘博等[9]通过生物学信息研究均发现miR-126和VEGF的3'UTR存在多个互补位点, 这预示着miR-126可通过与VEGFA 3'UTR的互补而抑制VEGFA的翻译, 因此VEGFA可能是miR-126负调控的靶基因. 在本研究中, 抑制胃癌细胞miR-126的表达, VEGFA及相应的下游靶蛋白明显的升高; 相反, 诱导胃癌细胞miR-126的表达, VEGFA及其相应的下游靶蛋白明显的降低. 因此, 我们推测, 在胃癌细胞中miR-126表达下调, 对VEGFA表达的抑制作用减弱, VEGFA表达量增加, 其下游信号通路PI3K/Akt及MAPK/Erk上的核心靶蛋白表达量也随之增加; 相反, miR-126表达上调, 对VEGFA表达的抑制作用增强, VEGFA表达量减少, 其下游信号通路PI3K/Akt及MAPK/Erk上的核心靶蛋白表达量也随之减少.

既往的研究已证实VEGF是目前发现促进肿瘤血管新生作用最强大的因子, VEGFA是VEGF家族中调控血管生成最重要的一员. VEGF/VEGFR胞内信号途径主要有两条[11]: MAPK/Erk与PI3K/Akt. Claesson-Welsh等[12]综述了VEGFA和肿瘤血管的关系, 其发现VEGFA主要是通过MAPK/ERK、MAPK/P38、PI3K/AKT及FAK等来调控肿瘤血管新生. 甚至包括我们前期对GC的研究证实, GC中存在VEGF/PI3K/Akt信号通路调控GC细胞的凋亡、增殖、化疗耐药及血管新生[13-15]. 因此, 我们推测VEGFA可能通过PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信号通路参与胃癌血管新生的调控.

Nicoli等[16]在对经典的斑马鱼生理性血管生长模型中的实验发现, miR-126在血管生长中扮演着"分子开关"的角色. Li等[17]和Feng等[8]的研究成果显示, miR-126在胃癌中呈下调表达. Chen等[18]在1194例亚洲胃癌患者与1618例正常对照组做了一项荟萃分析, 结果发现, 与对照组相比, VEGF在患有胃癌的亚洲患者体内表达显著增高. 加之我们前期研究发现, GC过高表达VEGF和VEGFR[1-3]. 结合本研究的研究结果, 我们推测胃癌中可能存在miR-126/VEGFA信号通路调控胃癌的血管新生.

评论

背景资料

胃癌的发病率和死亡率居我国恶性肿瘤之首. 目前研究发现, 肿瘤血管的新生在胃癌的发生和发展中可能有重要的地位, 但尚未找到有效靶点.

同行评议者

黄颖秋, 教授, 本溪钢铁(集团)总医院消化内科

研发前沿

目前已有大量的研究证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在胃癌的发生和发展中的重要作用, 但是其具体的作用机制及潜在靶点尚不明确, 尚需进一步研究.

相关报道

目前已有许多研究显示VEGF主要通过介导MAPK/Erk和/或PI3K/Akt两条信号通路调控肿瘤血管生长, 同时也有研究报道miR-126参与血管新生, 具体机制仍不清楚.

创新盘点

本文第一次证实了胃癌细胞中miR-126对VEGFA的调控作用, 其作用机制有待进一步研究.

应用要点

VEGF在胃癌血管新生发挥至关重要的作用, 肿瘤的血管新生在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色, 本文阐述了miR-126与VEGFA的关系, 为如何调控胃癌恶性表型提供了新的研究方向.

名词解释

miRCURY LNA™ miRNA: 是一种寡核苷酸RNA抑制剂, 可以抑制靶细胞相应RNA的表达.

同行评价

本文初步探讨了miR-126对胃癌细胞VEGFA及其下游靶蛋白的调控作用, 对该领域的进一步研究提供了实验依据, 有一定学术价值.

备注

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

参考文献

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