姜黄素联合奥沙利铂对肠癌RKO细胞增殖的抑制和凋亡的诱导

摘要

目的: 观察联合姜黄素和奥沙利铂对诱导人肠癌RKO细胞凋亡以及对凋亡相关蛋白表达的影响.

方法: 姜黄素和奥沙利铂单独及联合作用于RKO细胞, MTT法检测细胞增殖抑制率, 流式细胞术检测细胞凋亡, 免疫印记检测凋亡相关蛋白的表达.

结果: MTT结果表明单药姜黄素作用RKO细胞24、48和72 h的IC₅₀值分别为64.14 μmol/L±3.97 μmol/L、34.02 μmol/L±2.47 μmol/L和18.66 μmol/L±0.29 μmol/L. 单药奥沙利铂作用24、48和72 h的IC₅₀值为36.97 μg/mL±1.26 μg/mL、20.34 μg/mL±2.29 μg/mL和9.92 μg/mL±0.92 μg/mL. 选用低浓度的药物(20 μmol/L的姜黄素和10 μg/mL的奥沙利铂) 联合处理RKO细胞24 h, 结果显示与相应浓度姜黄素、奥沙利铂单药组相比, 两药联合组对RKO的增殖抑制率显著增强, 细胞凋亡率显著提高(P<0.05). 进一步研究发现姜黄素和奥沙利铂联合后, 诱导了PARP、caspase3和caspase8活化裂解.

结论: 姜黄素和奥沙利铂联合用药后, 可能通过诱导PARP、caspase3和caspase8裂解, 进而抑制肠癌RKO细胞增殖和诱导细胞凋亡.

关键词: 姜黄素; 奥沙利铂; 凋亡; 肠癌

核心提示: 低剂量姜黄素和奥沙利铂联合, 可协同抑制肠癌细胞增殖, 同时通过诱导caspase3、caspase8及PARP裂解, 诱导肠癌细胞凋亡.

Curcumin combined with oxaliplatin inhibits cell proliferation and induces apoptosis in human colorectal cancer cell line RKO

Lu-Lu Zhang, Xin Tan, Xiao Sun, Hao-Lan He

Lu-Lu Zhang, Xin Tan, Xiao Sun, Hao-Lan He, the Affiliated Center of Hospital, Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China

Supported by: the Science and Technology Fund of Health Bureau of Shenyang City, No. 2011048.

Correspondence to: Lu-Lu Zhang, Associate Chief Physician, the Affiliated Center of Hospital, Shenyang Medical College, 5 Nanqi West Road, Tiexi District, Shenyang 110024, Liaoning Province, China. zhanglulu1977@hotmail.com

Received: June 6, 2013
Revised: July 5, 2013
Accepted: July 18, 2013
Published online: August 28, 2013

Abstract

AIM: To explore whether curcumin and oxaliplatin have a synergistic effect on cell proliferation and apoptosis in human colorectal cancer cell line RKO.

METHODS: RKO cells were treated with curcumin and/or oxaliplatin. Cell proliferation was assessed by MTT assay. Cell apoptosis was determined using flow cytometry. Expression of apoptosis-related proteins was detected by Western blot.

RESULTS: The IC₅₀ of curcumin in RKO cells at 24, 48 and 72 h after treatment were 64.14 μmol/L ± 3.97 μmol/L, 34.02 μmol/L ± 2.47 μmol/L and 18.66 μmol/L ± 0.29 μmol/L, respectively. The IC₅₀ of oxaliplatin at 24, 48 and 72 h were 36.97 μg/mL ± 1.26 μg/mL, 20.34 μg/mL ± 2.29 μg/mL and 9.92 μg/mL ± 0.92 μg/mL, respectively. Curcumin (20 μmol/L) and oxaliplatin (10 μg/mL) synergistically inhibited cell proliferation and induced cell apoptosis. The expression of cleaved PARP, caspase 3, and caspase 8 was up-regulated after the combination treatment.

CONCLUSION: Curcumin combined with oxaliplatin inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis by regulating apoptosis-related protein expression in human colorectal cancer cell line RKO.

Key Words: Curcumin; Oxaliplatin; Apoptosis; Colorectal cancer

0 引言

大肠癌是我国常见的消化系恶性肿瘤之一, 其发病率仅次于胃癌和食管癌, 且呈逐年上升趋势[1]. 对于中晚期肠癌以化疗为基础的内科治疗成为首选治疗, 尽管新型化疗药物的应用使晚期肠癌患者的生存期有所提高, 但中位总生存时间仍然不超过24 mo[2]. 奥沙利铂是继顺铂、卡铂之后第3代铂类金属抗肿瘤药物, 他通过产生烷化物, 作用于DNA并以此为靶点, 与DNA链上的G共价键相结合, 形成链内、链间交链及DNA蛋白质交联, 造成DNA损伤, 从而抑制DNA的合成和复制, 使细胞发生死亡[3,4]. 有研究报道奥沙利铂可通过诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞, 但因其药物不良反应、耐药性等问题大大地限制了临床应用[5,6].

姜黄素是从植物姜黄中提取出来的一种酚类色素, 属于天然酚类抗氧化剂, 具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及清除自由基等多方面的药理作用, 其抗肿瘤作用日益引起人们的重视. 实验研究表明, 姜黄素可诱导肝癌、食管癌等多种肿瘤细胞凋亡[7,8]. 本研究观察了姜黄素联合奥沙利铂对人肠癌RKO细胞的作用以及对凋亡相关蛋白表达的影响, 旨在为肠癌的临床治疗提供相关的理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

姜黄素购自华美生科生物技术有限公司; 奥沙利铂为Sanofi-Aventis公司产品; RPML1640培养基购自美国GIBCO公司; 小牛血清购自上海实生细胞生物技术有限公司; 四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜购自美国Sigma公司; 鼠抗人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]、兔抗人caspase3和caspase8以及兔抗人β-actin抗体购自Santa Cruz公司; 辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司; ECL试剂盒购自PIERCE公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 人肠癌细胞系RKO为沈阳医学院中心实验室保存. 上述细胞在含10%胎牛血清、12 kU/L庆大霉素的RPMI 1640培养液中, 在37 ℃、饱和湿度及5%CO2的孵育箱内传代培养. 每周换液2-3次, 胰酶消化后传代.

1.2.2 细胞活力检测: 取对数生长期的肠癌RKO细胞株, 接种于96孔板内, 待细胞贴壁后加入各实验组药物. 每种浓度设4个复孔, 并设空白组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂). 之后每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL)25 μL, 继续孵育4 h, 小心吸弃孔内上清液. 加入二甲亚砜200 μL/孔, 振荡至结晶物充分溶解, 在酶联免疫测定仪上选择570 nm波长, 空白孔凋零, 测定各孔光吸收值, 计算各浓度组的增殖抑制率.

1.2.3 细胞凋亡检测: 将肠癌RKO细胞接种于6孔板内, 分别用药物处理24 h后, 收集对照组、姜黄素和/或奥沙利铂处理组细胞. 常规消化离心, 冷PBS洗2次, 加1 mL 700 mL/L乙醇(预冷) 固定, 4 ℃过夜保存. 次日弃上清, 将细胞悬于0.5 mL冷PBS中, 加10 mg/mL的RNase 10 μL, 37 ℃水浴30 min, 加0.5 mg/mL的PI染剂10 μL, 避光30 min, 流式细胞仪检测. CELLQUEST软件分析结果.

1.2.4 蛋白表达检测: 分别收集姜黄素和/或奥沙利铂处理的RKO细胞, 冰上裂解后离心, 提取上清蛋白, 紫外分光光度计法进行蛋白定量. 10%SDS-PAGE凝胶电泳分离, 通过电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜后, 在含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h. 加入一抗孵育过夜, TBST漂洗4次后, 加入辣根过氧化物酶标记二抗, 室温作用30 min, ECL法显色, GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理.

统计学处理 所有实验重复3次, 以mean±SD表示, 组间比较采用t检验, P<0.05差异有统计学意义.

2 结果

2.1 姜黄素和奥沙利铂对肠癌RKO细胞增殖的影响

分别将姜黄素(0、10、20、40、60、80 μmol/L)作用RKO细胞, MTT结果表明24、48和72 h的IC₅₀值分别为64.14 μmol/L±3.97 μmol/L、34.02 μmol/L±2.47 μmol/L和18.66 μmol/L±0.29 μmol/L(图1A). 奥沙利铂(0.1、1、10、100 μg/mL)作用于RKO细胞, 24、48和72 h的IC₅₀值为36.97 μg/mL±1.26 μg/mL、20.34 μg/mL±2.29 μg/mL和9.92 μg/mL±0.92 μg/mL(图1B). 为了观察两药的协同效应, 我们选用低浓度药物(20 μmol/L的姜黄素和10 μg/mL的奥沙利铂)单独及联合处理RKO细胞24 h. 结果显示, 与相应浓度姜黄素、奥沙利铂单药组相比, 联合组对RKO的增殖抑制率显著增强(P<0.05)(图1C). 我们的结果表明, 姜黄素和奥沙利铂联合应用能够有效抑制人肠癌RKO细胞增殖.

图1 姜黄素和奥沙利铂抑制人肠癌RKO细胞的增殖. A: 姜黄素作用RKO细胞24、48和72 h的IC₅₀值; B: 奥沙利铂作用RKO细胞24、48和72 h的IC₅₀值; C: 姜黄素(20 μmol/L)和奥沙利铂(10 μg/mL)单独及联合处理RKO细胞24 h, 对RKO细胞的增殖抑制作用. 联合处理组与单药组相比, ^aP<0.05.

2.2 姜黄素和奥沙利铂对RKO细胞凋亡的影响

流式分析发现, RKO细胞经低毒剂量的姜黄素(20 μmol/L)作用24 h后, 细胞凋亡率为2.79%, 而单药奥沙利铂(10 μg/mL)作用细胞24 h, 细胞凋亡率为4.01%, 与对照组相比均无统计差异. 姜黄素(20 μmol/L)联合奥沙利铂(10 μg/mL)作用细胞24 h, 细胞凋亡率增加至36.79%(P<0.05)(图2). 上述结果提示, 姜黄素和奥沙利铂协同诱导肠癌RKO细胞凋亡.

图2 流式细胞术检测姜黄素和奥沙利铂协同诱导RKO细胞凋亡的作用. A: 对照组RKO细胞; B: 单药姜黄素(20 μmol/L)作用RKO细胞24 h; C: 单药奥沙利铂(10 μg/mL)作用RKO细胞24 h; D: 联合姜黄素(20 μmol/L)和奥沙利铂(10 μg/mL)作用RKO细胞24 h.

2.3 姜黄素和奥沙利铂对RKO细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示, 单药姜黄素(20 μmol/L)及单药奥沙利铂(10 μg/mL)分别作用RKO细胞24 h, 对凋亡相关蛋白PARP、caspase3和caspase8蛋白的表达无显著影响. 而姜黄素与奥沙利铂联合用药组, 诱导了PARP、caspase3和caspase8裂解(图3).

图3 RKO细胞中, 姜黄素和奥沙利铂对凋亡相关蛋白PARP、caspase3和caspase8蛋白的影响. PARP: 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶.

3 讨论

大肠癌是当今世界范围内发病和死亡最常见的恶性肿瘤之一. 在我国的城市及农村均高居死亡原因前列. 随着生活方式的变化、期望寿命的延长、环境污染的加重, 其发病率仍在逐年上升. 目前研究认为大肠癌的发生、发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程, 在此过程中, 涉及癌基因的突变和活化、抑癌基因的丢失或表达失调以及凋亡调节机制紊乱等遗传学改变. 临床研究表明, 奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶/四氢叶酸可作为晚期结直肠癌的一线治疗方案, 对不同分化程度的肠癌均有较好的治疗效果[9,10]. 但大部分化疗药物在大剂量使用时不良反应较大, 并且长期使用容易产生耐药性.

近年来从天然植物中提取抗肿瘤药物已日益引起人们的重视. 姜黄素属于天然酚类抗氧化剂, 以往有学者在多种肿瘤中的研究初步证实: 姜黄素可抑制肿瘤细胞增殖, 诱导细胞发生凋亡. 赵东利等[11]研究发现姜黄素对小鼠移植瘤S180细胞具有显著增殖抑制作用. 李刚等[12]研究证实姜黄素对肾癌ACHN细胞生长具有显著抑制作用, 此外还发现姜黄素具有放射增敏作用. 陈小芬等[13]研究发现姜黄素呈剂量-时间依赖性方式抑制SKOV-3细胞增殖. 为了减少药物的不良反应, 并能够有效的杀伤肿瘤细胞, 我们选用低浓度的姜黄素及奥沙利铂联合作用于肠癌RKO细胞, 结果显示20 μmol/L的姜黄素和10 μg/mL的奥沙利铂联合应用时, 具有协同抑制肠癌RKO细胞增殖的作用. 进一步深入探讨其分子机制, 结果表明经低毒剂量的姜黄素(20 μmol/L)和奥沙利铂(10 μg/mL)单独作用RKO细胞24 h后, 细胞凋亡率分别为2.79%和4.01%, 与对照组相比无统计差异; 联合上述浓度的姜黄素和奥沙利铂作用RKO细胞24 h后, 凋亡细胞显著增加, 细胞凋亡率增至36.79%, 差异有统计学意义. 研究结果提示, 姜黄素和奥沙利铂联合用药能够协同抑制RKO细胞增殖, 同时诱导细胞凋亡.

细胞凋亡是一个受基因调控的多种信号传递系统参与的主动过程, 在细胞凋亡途径中, 首先激活的是启动型caspase, 如caspase8、caspase9, 而后通过级联放大过程激活执行型caspase, 如caspase3、caspase7等, 最终特异性地裂解其底物即PARP, 使细胞发生生化及形态学改变, 导致细胞凋亡[14-16]. 本研究中采用Western blot检测发现, 低剂量的姜黄素和奥沙利铂联合应用时, caspase3、caspase8及PARP出现了明显的裂解带, 而姜黄素和奥沙利铂单药组则未见明显裂解带, 结果提示低剂量的姜黄素和奥沙利铂联合用药后, 通过诱导caspase3、caspase8及PARP裂解, 进而抑制肠癌RKO细胞增殖和诱导细胞凋亡.

总之, 本研究证实联合低剂量的姜黄素和奥沙利铂, 可协同抑制肠癌细胞增殖, 同时通过诱导caspase3、caspase8及PARP裂解, 进而增加肠癌细胞凋亡, 为今后大肠癌的临床治疗提供了理论依据.

评论

背景资料

奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶/四氢叶酸作为晚期结直肠癌的一线治疗方案, 对不同分化程度的肠癌均有较好的治疗效果, 但长期使用容易产生耐药性. 以往研究初步证实姜黄素可抑制肿瘤细胞增殖, 诱导细胞发生凋亡.

同行评议者

白雪, 副主任医师, 中国人民解放军北京军区总医院普通外科

研发前沿

姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及清除自由基等多方面的药理作用, 其抗肿瘤作用日益引起人们的重视. 本研究观察了姜黄素联合奥沙利铂对人肠癌细胞的作用, 旨在为肠癌的临床治疗提供相关的理论依据.

相关报道

赵东利等发现姜黄素对小鼠移植瘤具有显著增殖抑制作用. 李刚等证实姜黄素对肾癌生长具有显著抑制作用, 还发现其具有放射增敏作用. 陈小芬等发现姜黄素显著抑制SKOV-3细胞增殖.

创新盘点

本研究观察了姜黄素联合奥沙利铂对人肠癌RKO细胞的作用以及对凋亡相关蛋白表达的影响, 旨在为肠癌的临床治疗提供相关的理论依据.

应用要点

联合低剂量的姜黄素和奥沙利铂, 可协同抑制肠癌细胞增殖, 同时通过诱导caspase3、caspase8及PARP裂解, 进而增加肠癌细胞凋亡, 为今后大肠癌的临床治疗提供了理论依据.

同行评价

本文的科学性、创新性和可读性能较好地反映我国胃肠病学临床基础研究水平.

备注

编辑: 田滢 电编: 闫晋利

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