LPS通过p38/MAPK调控胆管癌细胞系ICBD的上皮间质转化

摘要

目的: 探讨脂多糖(lipopolysacoharides, LPS)对胆管癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响和可能机制.

方法: 将胆管癌ICBD细胞分为4组: 正常对照组、LPS诱导实验组(终浓度10 μg/mL)、LPS+siRNA转染组和LPS+SB-203580诱导实验组. 应用Real-time RT-PCR与Western blot法检测上皮细胞表面标志E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质细胞表面标志波形蛋白(Vimentin)的表达变化以及Toll样受体4(Toll-like receptors 4, TLR4)和p38的表达变化.

结果: LPS促进胆管癌细胞系ICBD的EMT发生; ICBD细胞的EMT过程伴随TLR4、p38表达增加; 应用siRNA阻断TLR4后, ICBD细胞的EMT消失, LPS导致p38的上调表达作用也消失; 应用SB-203580阻断p38后, 与正常对照组相比, TLR4的表达增加, 与LPS诱导实验组相比无明显变化, 但ICBD细胞的EMT消失.

结论: LPS可以激活TLR4, 并通过p38/MAPK促进胆管癌细胞ICBD的上皮间质转化.

关键词: 上皮间质转化; 胆管癌细胞; 脂多糖; Toll样受体4; p38; p38/MAPK

核心提示: 本研究证实脂多糖(lipopolysacoharides)能够通过TLR4/p38/MAPK信号通路调控胆管癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的发生, 这对胆管癌侵袭和转移机制的研究及治疗具有一定的价值. 如果能够使具有间质特性的细胞恢复上皮细胞特性, 就有可能逆转EMT, 阻止癌细胞的侵袭和转移, 这为临床上胆管癌的治疗提供了新的思路.

LPS regulates epithelial-mesenchymal transition in cholangiocarcinoma cell line ICBD via the p38/MAPK signaling pathway

Hang-Yu Li, Yan Li, Dan Liu, Hong-Zhi Sun, Jin-Gang Liu

Hang-Yu Li, Yan Li, Dan Liu, Jin-Gang Liu, Department of Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Hong-Zhi Sun, Department of Surgery, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81071955; the Scientific Research Foundation of Educational Department of Liaoning Province, No. L2010634

Correspondence to: Jin-Gang Liu, Professor, Department of Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. liujg@sj-hospital.org

Received: April 17, 2013
Revised: June 26, 2013
Accepted: July 3, 2013
Published online: July 28, 2013

Abstract

AIM: To investigate the effect of LPS on epithelial-mesenchymal transition (EMT) of cholangiocarcinoma ICBD cells and to explore the possible mechanisms involved.

METHODS: ICBD cells were randomly divided into four groups: a control group, a LPS (final concentration, 10 μg/mL) group, a LPS + siRNA group, and a LPS + SB203580 group. The expression of epithelial cell surface marker E-Cadherin, stromal cell surface marker Vimentin, TLR4 and p38 was examined by real-time RT-PCR and Western blot.

RESULTS: LPS promoted the initiation of EMT of ICBD cells. The expression of TLR4 and p38 significantly increased in the process of EMT of ICBD cells. SiRNA-mediated blockage of TLR4 inhibited the occurrence of EMT and the up-regulation of p38 in ICBD cells. When p38 was blocked by SB-203580, the expression of TLR4 was still up-regulated, but EMT of ICBD cells did not occur compared to the control group.

CONCLUSION: LPS may activate TLR4 and promote EMT of cholangiocarcinoma cells via the p38/MAPK signaling pathway.

Key Words: Epithelial-mesenchymal transition; Cholangiocarcinoma cells; Lipopolysacoharide; Toll-like receptor 4; P38; P38/MAPK

0 引言

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞失去极性和上皮表型, 通过特定程序转化为间质细胞的生物学过程[1]. EMT的主要分子特征是: 上皮细胞标记物(如细胞角蛋白, cytokeratin; E-钙黏蛋白, E-cadherin)表达下调, 间质表型标志物[如α-平滑肌肌动蛋白( α-smooth muscle actin, α-SMA)]; 波形蛋白(Vimentin)表达上调, 从而获得迁移与侵袭的能力, 这一过程与恶性肿瘤的浸润转移密切相关[2]. 近年来研究发现在胆管癌中也存在EMT现象[3], 但目前关于胆管癌中EMT发生的机制尚不明确.

Toll样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)是最重要的模式识别受体之一, 通过识别病原微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)介导免疫反应, 另外, TLRs还能够识别某些内源性配体, 这些配体称之为损伤相关分子模型(damage-associated molecular patterns, DAMPs)[4]. 在肿瘤的侵袭和转移过程中, 有大量的DAMPs和PAMPs释放. 越来越多的证据表明, TLRs通过识别肿瘤组织中的DAMPs和PAMPs参与多种肿瘤的发生和发展[5]. 在肿瘤微环境中, 脂多糖(lipopolysacoharides, LPS)作为一种PAMPs发挥作用, 最初研究认为是被免疫细胞表面的TLRs识别, 近年来发现肿瘤细胞表面的TLRs也能够识别LPS, 调控肿瘤的生物学行为. 但在胆管癌中LPS如何调控胆管癌的发生发展尚不清楚.

LPS是革兰氏阴性杆菌外膜的重要组成部分, 作为TLR4的重要配体参与信号的跨膜转导. LPS激活TLRs信号转导通路, 活化下游的多种效应蛋白, 进而激活多种信号通路, 包括MAPK通路、PI3K通路等[6,7]. p38是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)家族的成员之一, 他能感受外界刺激信号, 并将转导至细胞及其核内, 引起细胞的增殖、分化、侵袭和凋亡等细胞生物学反应[8]. 我们的前期实验已证实在胆管癌中TLR4表达水平明显高于癌旁组织, 那么LPS能否通过激活TLR4, 活化p38/MAPK通路, 进而介导胆管癌细胞EMT的发生有待于进一步研究. 本研究应用LPS对胆管癌细胞ICBD进行体外干预, 探讨其对胆管癌EMT发生的影响及其机制, 并为临床胆管癌的治疗寻找新的靶点.

1 材料和方法

1.1 材料

人胆管癌细胞系ICBD购自上海艾研生物科技有限公司, LPS购自Sigma公司, p38与p-p38抗体购自Santa Cruz公司(Santa Cruz, CA, USA), E-cadherin、Vimentin抗体购自Abcam公司, HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物有限公司, RNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司, RNA PCR Kit购自Promega公司, p38抑制剂SB-203580购自Sigma公司, siRNA由Sigma公司提供.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 人胆管癌细胞系ICBD于10%胎牛血清DMEM培养液中, 37 ℃, 5%CO₂培养, 2-3 d用0.25%胰酶消化传代. 取对数生长期的细胞进行试验.

1.2.2 实验分组: ICBD细胞培养方式同前. 细胞分成4组: 正常对照组、LPS诱导实验组(终浓度10 μg/mL)、LPS+siRNA转染组和LPS+SB-203580诱导实验组.

1.2.3 Western blot检测E-cadherin、Vimentin、TLR4、p38、p-p38蛋白的表达: 按分子克隆方法提取细胞总蛋白, 经Bradford法测定蛋白浓度; 各组取60-100 g总蛋白进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电泳后转膜, 5%脱脂奶粉于室温封闭1 h, 加入相应一抗, 4 ℃孵育过夜, 辣根过氧化物酶二抗(1:3000)于室温孵育2 h, ECL显色后以GAPDH为内参照, 用Image J图像分析软件进行灰度分析.

1.2.4 Real-time RT-PCR检测E-cadherin、Vimentin、TLR4、p38 mRNA的表达: LPS刺激24 h后, 分别收集各组细胞, 提取总RNA, 测定A260/280为1.75-1.95. 取2 μg RNA, 应用逆转录试剂盒按20 μL逆转录体系合成cDNA. PCR引物由应用软件Prima5.0设计(表1), 由北京鼎国合成. 荧光定量PCR反应体系为25 μL, 内含500 ng cDNA模板, 终浓度为250 nmol/L的上下游引物及SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL. 反应条件为95 ℃ 60 s; 95 ℃ 15 s; 退火15 s; 72 ℃ 45 s, 荧光收集, 40个循环. 每个样本重复3次. 以相对Ct值(即2^-∆∆Ct)表示目的基因的相对表达量, 以空白细胞为对照.

表1 Real-time RT-PCR引物序列.

引物名称		扩增片段(bp)
E-cadherin	F: 5'-CCGCCATCGCTTACA-3'	262
	R: 5'-GGCACCTGACCCTTGTA-3'
Vimentin	F: 5'-ACAGGCTTTAGCGAGTTATT-3'	296
	R: 5'-AAGAGGCGAACGAGGG-3'
Toll样受体4	F: 5'-AGCTCTGCCTTCACTAC-3	191
	R: 5'-GATGATACCAGCACGAC-3'
p38	F: 5'-GCTGAAGATTCTGGATTTTG-3'	173
	R: 5'-GTTCTTCCAGTCAACAGCTC-3'
GAPDH	F: 5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'	312
	R: 5'-TCGCTCCTGGAAGATGG-3'

统计学处理 采用SPSS13.0统计软件, 对上述检测结果进行t检验和方差分析, 检验水准P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 LPS可以促进胆管癌细胞系ICBD的EMT发生

Western blot结果显示, 与对照组细胞相比, 经过LPS诱导的胆管癌细胞ICBD中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白的表达显著降低, 而间皮细胞的标志物Vimentin蛋白的表达显著升高(图1A). Real-time RT-PCR结果显示: LPS诱导实验组E-cadherin mRNA的表达显著降低, 而间皮细胞的标志物Vimentin mRNA的表达显著升高(图1B). 以上结果提示: 经过LPS处理后, ICBD细胞中上皮细胞标志物表达逐渐消失, 而间质细胞标志物表达逐渐增加, LPS可以促进ICBD细胞EMT的发生.

图1 对照组与LPS诱导组E-cadherin及Vimentin的表达变化. A: Western blot检测E-cadherin及Vimentin蛋白表达变化; B: Real-time RT-PCR检测E-cadherin及Vimentin mRNA表达的变化. LPS: 脂多糖.

2.2 ICBD细胞EMT过程中伴随有TLR4、p-p38表达增加

Western blot结果显示(图2A), 与对照组细胞相比, LPS诱导发生EMT的ICBD细胞中TLR4与p-p38蛋白表达显著增加(P<0.05), p38总蛋白的表达无明显变化(P>0.05). Real-time PCR结果显示(图2B), TLR4、p38 mRNA水平的表达情况与蛋白水平一致(P<0.05).

图2 对照组与LPS诱导组TLR4、p38的表达变化. A: Western blot检测TLR4、p38及p-p38蛋白表达变化; B: Real-time RT-PCR检测TLR4及p38 mRNA表达的变化. TRL4: Toll样受体4; LPS: 脂多糖.

2.3 LPS通过激活TLR4/p38/MAPK通路调控胆管癌ICBD细胞EMT

如图3所示, 应用siRNA阻断TLR4后, LPS刺激ICBD细胞, 与对照组相比, E-cadherin、Vimentin以及p-p38的表达无明显变化, 说明没有发生EMT. 经过SB-203580预处理后的ICBD细胞, 与对照组相比, 在LPS的作用下TLR4的表达仍上调, 但E-cadherin和Vimentin的表达无明显变化, 也没有发生EMT. 此结果说明, LPS促进ICBD细胞EMT是通过TLR4和p38来实现的, 而且p38位于TLR4的下游, 可以通过阻断TLR4抑制LPS对p38表达的影响.

图3 TLR4 siRNA及阻断p-p38后对LPS诱导的EMT的影响. TRL4: Toll样受体4; EMT: 上皮间质转化; LPS: 脂多糖.

3 讨论

EMT是指某些生理或者病理刺激下上皮细胞失去其上皮特征, 获得间质特性的过程, 如组织修复, 伤口愈合和器官发育等生理过程[9,10], 而病理刺激包括组织纤维化以及肿瘤发生发展的过程, 是导致肿瘤发生侵袭转移的重要机制之一[11,12]. 肿瘤细胞发生EMT后, 最重要的标志性变化是上皮细胞标志物E-cadherin的缺失, 这也是上皮肿瘤细胞侵袭的前提条件, 同时也伴有间质细胞表型Vimentin表达的上调[13], 因此可以通过检测这两类细胞表面的特异性标志物来鉴定EMT的发生.

胆管癌的发生发展过程极其复杂, 一般认为对胆道的长期炎症刺激导致胆管壁慢性增生性炎症, 继而引起胆管黏膜上皮的不典型增生, 这种不典型增生是胆管癌的癌前病变, 所以胆管癌多伴有胆道感染, 胆道感染与其解剖学位置有关, 细菌经胆胰壶腹逆行进入胆道, 主要以革兰阴性菌感染为主. LPS即革兰阴性菌内毒素(endotoxin), 是革兰阴性细菌的细胞壁组成成分, 具有广泛的生物学活性. 那么, 在胆管癌细胞的微环境中存在LPS, 并可能对胆管癌的发生发展起重要作用. 我们的实验发现, 在LPS的刺激下胆管癌细胞ICBD上皮细胞标志E-cadherin消失, 间质细胞标志Vimentin的表达上调, 使其获得间质化表型, 也就说胆管癌细胞ICBD在LPS的诱导下发生EMT.

LPS是通过何种方式调控胆管癌细胞EMT发生的呢？以往的研究发现, p38/MAPK通路能够调控多种肿瘤的EMT发生[14]. MAPK是细胞内重要的信号转导通路之一, 其信号转导异常可导致恶性肿瘤快速增殖、无限生长, 并参与调控肿瘤细胞的基因表达、分化、凋亡、侵袭和转移等生物学效应[15]. p38是MAPK家族成员之一, 研究发现, 在肿瘤细胞中细胞外多种应激如低氧、一些促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、白介素-6)、脂多糖和革兰氏阳性菌的细胞壁成分等均可激活p38/MAPK通路[16,17]. TLRs属于Ⅰ型跨膜受体, 他能够感受肿瘤微环境的改变, 将信号转导至细胞内, 启动一系列免疫反应, 进而促进肿瘤的增殖、侵袭等. LPS作为TLR4的一种主要配体, 能够激活TLR4信号转导通路, 导致下游的多种效应蛋白表达上调, 进而活化MAPK通路, 调控肿瘤的发生发展. 我们通过Western blot与Real-time RT-PCR法证实, 在LPS诱导ICBD细胞EMT的同时, TLR4、p38的表达明显上调, 说明TLR4、p38可能参与了LPS诱导胆管癌ICBD细胞 EMT的过程. 进一步的阻断实验发现, 阻断TLR4, EMT消失, p38的表达上调消失, 说明LPS是通过TLR4调控胆管癌细胞的EMT; 阻断p38, EMT消失, 与对照组相比, TLR4的表达仍增加, 说明LPS通过TLR4和p38调控胆管癌的EMT, 而且p38位于TLR4的下游. 该结果提示LPS诱导胆管癌细胞EMT改变是通过TLR4/p38/MAPK发挥作用.

总之, 我们的实验证实了LPS能够诱导胆管癌细胞EMT的发生, 这一过程是通TLR4/p38/MAPK信号通路调控, 这对胆管癌侵袭和转移机制的研究及治疗具有一定的价值. 如果能够使具有间质特性的细胞恢复上皮细胞特性, 就有可能逆转EMT, 阻止细胞的侵袭和转移, 这为临床上胆管癌的治疗提供了新的思路.

评论

背景资料

在我国, 胆管癌是死亡率很高的恶性肿瘤之一, 导致患者预后差、死亡率高的重要原因是肿瘤的侵袭转移. 上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞失去极性和上皮表型, 通过特定程序转化为间质细胞的生物学过程, 与恶性肿瘤的浸润转移密切相关. 因此研究胆管癌的EMT过程对于改善预后、降低患者死亡率至关重要, 并为临床胆管癌的治疗寻找新靶点.

同行评议者

宋振顺, 教授, 西京医院肝胆外科; 康春博, 副主任医师, 北京大学航天临床医院普通外科

研发前沿

胆管癌的侵袭转移机制非常复杂, EMT对胆管癌侵袭转移的机制日益引起人们的关注, 对于胆管癌EMT过程的调控是目前研究的热点问题.

相关报道

EMT与恶性肿瘤的浸润转移密切相关, 以往的研究发现在多种肿瘤组织存在EMT现象. Antoon等最新研究发现p38/MAPK通路能够调控多种肿瘤的EMT过程.

创新盘点

本研究应用脂多糖(lipopolysacoharides, LPS)对胆管癌细胞ICBD进行体外干预, 探讨LPS对胆管癌细胞上皮间质转化的影响和可能机制, 旨在为将来组织水平研究胆管癌的浸润转移机制提供理论基础, 并为胆管癌的治疗打开一个新的思路. 截至目前, 有关EMT在胆管癌浸润转移中的研究鲜见报道.

应用要点

本研究结果表明LPS促进胆管癌细胞系ICBD的EMT发生; LPS激活TLR4, 通过p38/MAPK促进胆管癌细胞ICBD的EMT过程. 这对胆管癌浸润转移机制的阐明和治疗提供理论基础.

同行评价

本课题设计合理, 研究过程严谨, 数据分析方法正确, 立题新颖, 具有一定的科研价值, 为胆管癌的临床治疗提供了一个新的思路.

备注

编辑: 田滢 电编:鲁亚静

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