环巴胺对胃癌MKN45细胞株VEGF、MMP-2、MMP-9基因表达的影响

摘要

目的: 研究环巴胺诱导胃癌MKN45细胞凋亡的作用及其对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)表达的影响.

方法: 以胃癌MKN45细胞为研究对象, MTT法检测不同浓度环巴胺作用不同时间对MKN45细胞的增殖抑制作用. 应用流式细胞仪测定细胞凋亡率及细胞周期分布. RT-PCR检测环巴胺对VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响.

结果: 不同浓度(7.5、15、30、60、90、120 μmol/L)的环巴胺对人胃癌MKN45细胞均有增殖抑制作用, 且呈时间和剂量依赖性. 30、60、90 μmol/L环巴胺作用MKN45细胞24 h后凋亡率分别为18.45%±0.57%、39.77%±0.61%、68.52%±0.89%, 明显高于阴性对照组的细胞凋亡率2.08%±0.49%, 差异具有统计学意义(P<0.05). 细胞周期分析显示, 随着环巴胺浓度升高, G0/G1期细胞比例逐渐增多, S期细胞比例逐渐减少, 细胞发生G₀/G₁期阻滞(P<0.05). RT-PCR检测显示环巴胺作用24 h后, VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达明显下降, 且随着药物浓度的增高表达量逐渐减少(P<0.05).

结论: 环巴胺对胃癌细胞MKN45具有明显的增殖抑制及促凋亡作用, 其机制可能与下调肿瘤侵袭转移相关基因VEGF、MMP-2、MMP-9的表达有关.

关键词: 环巴胺; 胃癌; 细胞凋亡; 血管内皮细胞生长因子; 基质金属蛋白酶-2; 基质金属蛋白酶-9

核心提示: 本研究显示环巴胺对胃癌细胞有抗肿瘤作用, 其机制可能与血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9)的表达有关, 为胃癌的药物治疗提供新思路, 为环巴胺的临床应用提供理论依据.

Effect of cyclopamine on expression of VEGF, MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cell line MKN45

Xue-Ping Ren, Quan-An Zhang, Qin Zheng

Xue-Ping Ren, Quan-An Zhang, Qin Zheng, Department of Oncology, the Second Hospital of Nanjing Affiliated to Southeast University, Nanjing 210003, Jiangsu Province, China

Correspondence to: Quan-An Zhang, Chief Physician, Department of Oncology, the Second Hospital of Nanjing Affiliated to Southeast University, 1-1 Zhongfu Road, Gulou District, Nanjing 210003, Jiangsu Province, China. cancerarticle@163.com

Received: April 11, 2013
Revised: April 22, 2013
Accepted: April 27, 2013
Published online: June 8, 2013

Abstract

AIM: To investigate the effect of cyclopamine on cell apoptosis and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in gastric cancer cell line MKN45.

METHODS: After MKN45 cells were treated with different concentrations of cyclopamine (7.5, 15, 30, 60, 90, 120 μmol/L) for different durations, cell proliferation was assessed by MTT assay, cell apoptosis and cell cycle progression were determined by flow cytometry, and expression of VEGF, MMP-2 and MMP-9 mRNAs was detected by RT-PCR.

RESULTS: Cyclopamine inhibited the growth of MKN45 cells in a time- and dose-dependent manner. The apoptosis rates of MKN45 cells treated with 30, 60, 90 μmol/L of cyclopamine for 24 h were significantly higher than that of non-treated cells (18.45% ± 0.57%, 39.77% ± 0.61%, 68.52% ± 0.89% vs 2.08% ± 0.49%, all P < 0.05). The percentage of cells in G₀/G₁ phase was increased while that in S phase was decreased in cyclopamine-treated cells, and cell cycle was arrested in G₀/G₁ phase. Treatment with cyclopamine for 24 h decreased the expression levels of VEGF, MMP-2 and MMP-9 mRNA in a dose-dependent manner (all P < 0.05).

CONCLUSION: Cyclopamine inhibits cell proliferation and induces apoptosis in gastric cancer cell line MKN45 via mechanisms possibly associated with down-regulating the expression of tumor invasion-related genes VEGF, MMP-2 and MMP-9.

Key Words: Cyclopamine; Gastric cancer; Apoptosis; vascular endothelial growth factor; MMP-2; MMP-9

0 引言

胃癌是我国最常见的消化系恶性肿瘤之一, 胃癌细胞的侵袭和转移是抗肿瘤治疗失败的重要原因, 血管新生及细胞外基质降解是肿瘤侵袭转移的重要环节[1]. 参与肿瘤血管生成的因子很多, 其中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是迄今为止发现的作用最强的促血管生长因子[2]. 基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)家族中的重要成员, 能有效降解基底细胞膜及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)[3]. 本实验旨在观察环巴胺对胃癌MKN45细胞株的生长抑制作用及其对VEGF、MMP-2、MMP-9基因表达的影响, 探讨其可能的作用机制, 为环巴胺的临床应用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

胃癌MKN45细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供. 环巴胺(cyclopamine)购自Biomol公司产品; RPMI 1640培养基、胎牛血清购自杭州四季青有限公司; 四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司; Annexin V/PI凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司; TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司; RT-PCR试剂盒购自宝生物工程大连有限公司; VEGF、MMP-2、MMP-9基因引物由上海生工生物工程公司合成.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 胃癌MKN45细胞用含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液, 在37 ℃、5%饱和湿度条件下培养, 1-2 d更换培养液1次, 每2-3 d传代一次, 实验时选用对数生长期细胞.

1.2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率: 取对数生长期MKN45细胞, 用胰酶消化制成单细胞悬液, 调整细胞浓度为1×10⁵/mL, 接种于96孔板, 每孔200 μL. 分为实验组、空白对照组及阴性对照组, 实验组加入终浓度为7.5、15、30、60、90、120 μmol/L的环巴胺, 空白对照组不含细胞仅加入培养液, 阴性对照组含有细胞并加入等量溶剂; 每组设6个复孔. 分别于加药后24、48和72 h检测, 每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL; 继续孵育4 h, 离心、弃上清液, 每孔加入150 μL DMSO, 摇床混匀充分溶解颗粒; 酶联检测仪于波长540 nm处测定吸光度(A)值. 实验重复3次, 取平均值.

1.2.3 流式细胞术测定细胞凋亡率: 取对数生长期细胞, 以每孔5×10⁶个细胞接种于六孔培养板, 细胞贴壁生长后, 加入终浓度分别为30、60、90 μmol/L的环巴胺, 培养24 h后, 收集各组细胞, 调整细胞浓度为1×10⁶/mL, 取100 μL悬液, 加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI, 避光反应15 min, 加入300 μL 1×Annexin-V缓冲液, 流式细胞仪测定细胞凋亡率.

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期: 取对数生长期的细胞, 接种于100 mL培养瓶, 培养24 h后, 加入终浓度为30、60、90 μmol/L的环巴胺, 另设阴性对照组, 孵育24 h后, 胰酶消化收集各组细胞, 4 ℃ PBS洗涤2次. 离心后加入预冷的70%乙醇, 固定过夜, 冷PBS洗涤后, 加入RNase和PI, 避光染色30 min, 流式细胞仪分析细胞周期分布. 实验重复3次.

1.2.5 RT-PCR检测VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA表达: 收集30、60、90 μmol/L环巴胺作用24 h后的MKN45细胞, TRIzol法提取总RNA, 逆转录成cDNA, 进行PCR扩增. β-actin: 上游引物为5'-CCAACTAATGTTCAGCGTTA-3', 下游引物5'-TACGATGATAGGAATGGTTG-3', 扩增片段400 bp; VEGF: 上游引物5'-ACTTT- CTGCTGTCTTGGATG-3', 下游引物5'-CTCGGCTTGTCACATCACCG-3', 扩增片段227 bp; MMP-2: 上游引物5'-CTTCCTTCAAGGACCGGTAG-3', 下游引物5'-GTCTGGCTTGGGGTAGGCTA-3', 扩增片段606 bp; MMP-9: 上游引物5'-TGGGAACCAGCTGTGCGGAT-3', 下游引物5'-CGTGTGTACACCCA AGACGC-3', 扩增片段325 bp. PCR反应条件如下: 94 ℃预变性5 min, 随后94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 min, 共30个循环. PCR产物行琼脂糖凝胶电泳, 利用凝胶成像系统扫描、拍照, 分析数据. 实验重复3次. 以β-actin作为内参照, 计算VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量.

统计学处理 所得数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析. 计量资料以mean±SD表示. 多样本比较采用单因素方差分析; 组间比较采用t检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 环巴胺对MKN45细胞的增殖抑制作用

不同浓度(7.5、15、30、60、90、120 μmol/L)的环巴胺作用于MNK45细胞24、48、72 h后, MKN45细胞的生长均受到不同程度抑制, 随着药物浓度的升高及作用时间的延长, 细胞增殖抑制作用逐渐增强, 其增殖抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关(P<0.05, 图1).

图1 不同浓度环巴胺作用不同时间对胃癌MKN45细胞增殖的影响.

2.2 环巴胺对MKN45细胞凋亡的影响

经30、60、90 μmol/L的环巴胺作用24 h后, MKN45细胞的凋亡率分别为18.45%±0.57%、39.77%±0.61%、68.52%±0.89%, 明显高于阴性对照组的细胞凋亡率2.08%±0.49%, 差异具有统计学意义(P<0.05). 且随着环巴胺药物浓度的逐渐升高, 细胞凋亡率亦逐渐增加, 各浓度组间比较差异有统计学意义(P<0.05).

2.3 环巴胺对MKN45细胞周期的影响

不同浓度环巴胺作用24 h后细胞周期受到不同程度的影响, 与阴性对照组比较, 环巴胺组G₀/G₁期比例明显增高, S期细胞比例下降, 且随着药物浓度的增加, G₀/G₁期细胞比例逐渐升高, S期细胞比例逐渐减少, 细胞发生G₀/G₁期阻滞, 各组间差异具有统计学意义(P<0.05, 表1).

表1 不同浓度环巴胺作用24 h后MKN45细胞周期分布 (mean±SD, n = 3, %).

环巴胺(μmol/L)	G0/G1期	S期	G2/M期
0	57.71±1.35	26.13±0.98	16.16±0.44
30	66.76±1.45a	17.86±2.55a	15.38±3.08
60	76.54±1.49ab	12.32±1.88ab	11.14±1.03ab
90	84.32±1.66abc	7.91±1.35abc	7.77±1.87abc

^aP<0.05 vs 0 μmol//L组;

^bP<0.01 vs 30 μmol//L组;

^cP<0.05 vs 60 μmol//L组.

2.4 环巴胺对MKN45细胞VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达的影响

RT-PCR结果显示, 空白对照组及阴性对照组的基因表达水平无显著差异, 而不同浓度的环巴胺处理胃癌MKN45细胞24 h后, 细胞内VEGF、MMP-2、MMP-7 mRNA的表达明显下降, 与空白对照组及阴性对照组相比, 差异具有统计学意义(P<0.05), 且随着环巴胺药物浓度的增加, 各基因的表达量逐渐减少, 各浓度组间差异亦有统计学意义(P<0.05, 图2-4).

图2 不同浓度环巴胺对MKN45细胞VEGF mRNA表达的影响. ^aP<0.05 vs 空白对照组, 阴性对照组; ^cP<0.05 vs 30 μmol//L组; ^eP<0.05 vs 60 μmol/L组.

图3 不同浓度环巴胺对MKN45细胞MMP-2 mRNA表达的影响. ^aP<0.05 vs 空白对照组, 阴性对照组; ^cP<0.05 vs 30 μmol//L组; ^eP<0.05 vs 60 μmol/L组.

图4 不同浓度环巴胺对MKN45细胞MMP-9 mRNA表达的影响. ^aP<0.05 vs 空白对照组, 阴性对照组; ^cP<0.05 vs 30 μmol//L组; ^eP<0.05 vs 60 μmol/L组.

3 讨论

胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程, 其预后与分化程度、浸润深度、病理分期、淋巴结转移及远处转移等密切相关[4,5]. 目前胃癌治疗效果差, 且在治疗过程中常出现耐药、复发和转移. 环巴胺是一种藜芦属类固醇植物碱, 并在多种肿瘤细胞中发挥抗肿瘤作用, 但对其研究大多集中在Hedgehog信号通路[6-8], 关于其他方面的研究较少, 其是否通过其他途径发挥抗肿瘤作用尚不明确.

MKN45细胞为低分化细胞株, 恶性程度高, 本研究我们用环巴胺对MKN45进行干预, MTT结果显示环巴胺对胃癌MKN45细胞具有明显的增殖抑制作用. 环巴胺作用于胃癌MKN45细胞24 h后细胞凋亡率显著升高, 与对照组比较, 差异有统计学意义. 细胞周期分析显示环巴胺使MKN45细胞增殖阻滞于G0/G1期.

肿瘤细胞的侵袭转移是一个复杂的过程, 其中包括肿瘤血管新生、细胞外基质降解、细胞增殖改变、细胞黏附改变及细胞迁移等环节[9,10]. 肿瘤血管新生与肿瘤的生长、浸润和转移密切相关, 是肿瘤侵袭转移的必要条件[11,12]. 参与肿瘤血管生成的因子很多, 其中VEGF是迄今为止发现的作用最强、最重要的促血管生长因子. VEGF能特异性地促进血管内皮细胞增殖、分化和迁移, 趋化肿瘤细胞, 诱导肿瘤血管生成, 促进肿瘤生长、侵袭及转移[13,14]. Zhao等[15]采用免疫组织化学法检测107例胃癌组织和31例癌旁正常胃组织, 结果表明, VEGF在正常胃组织中呈低表达或无表达, 在胃癌组织中呈高表达, 且表达水平与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和病理分期呈正相关. Liu等[16]进行的一项荟萃分析包括44项研究, 共计4794例胃癌根治术患者, 结果显示, 对于胃癌根治术后患者, VEGF阳性者比阴性者生存率低, 同时VEGF阳性表达者胃癌肿块大, 易浸润, 更易发生血行转移, 分期多为进展期, 多因素分析证实VEGF是独立的预后指标.

肿瘤的侵袭转移亦涉及到ECM的破坏, 细胞外基质的降解是肿瘤浸润和转移的先决条件[17]. MMPs是具有锌指结构的蛋白水解酶, 是降解细胞外基质蛋白最主要的蛋白水解酶, 在肿瘤的浸润和转移中发挥着至关重要的作用[18]. MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成员, 能有效降解基底细胞膜及细胞外基质, 促进血管内皮细胞迁移及血管重塑, 并能上调VEGF, 促进肿瘤血管新生, 是启动血管生成的重要因子[19]. Hwang等[20]采用免疫组织化学法检测189例胃癌组织中MMP-2和MMP-9的表达水平, 并分析其与肿瘤的浸润、临床病理特征和临床结果的相关性, 结果表明, MMP-2、MMP-9在正常胃组织黏膜及癌旁组织中呈低表达, 在胃癌组织呈高表达, 且阳性表达程度与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关. MMP-2、MMP-9的异常表达在胃癌的发生发展、浸润转移过程中发挥了重要作用, 可作为判断胃癌患者预后的独立指标.

我们进一步研究发现, 不同浓度的环巴胺作用于MKN45细胞24 h后, VEGF、MMP-2及MMP-9 mRNA的表达水平下降, 且随着药物浓度增高, 表达量逐渐减少. 环巴胺可能通过抑制VEGF、MMP-2及MMP-9的基因表达, 进而减少肿瘤浸润转移, 从而发挥抗肿瘤作用.

总之, 本研究结果表明环巴胺可抑制MKN45细胞的增殖, 并诱导其凋亡, 其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期以及下调细胞中VEGF、MMP-2及MMP-9基因的表达有关, 为胃癌患者的治疗提供新的途径及理论依据.

评论

背景资料

胃癌是最常见的消化系恶性肿瘤之一, 其预后与肿瘤分化程度、浸润深度、病理分期、淋巴结转移及远处转移等密切相关. 目前胃癌治疗效果差, 在治疗过程中常出现耐药、复发和转移, 因此寻找高效低毒的药物成为目前研究的热点.

同行评议者

李革, 副教授, 延边大学附属医院

研发前沿

多数胃癌患者确诊时为晚期, 药物治疗是胃癌治疗的基础. 环巴胺是一种藜芦属类固醇植物碱, 研究发现其在多种肿瘤细胞中发挥抗肿瘤的作用, 环巴胺作为一种潜在的抗肿瘤新药在世界范围内掀起了研究热潮.

相关报道

Zheng等研究发现, 在胃癌组织中VEGF、MMP-2和MMP-9的表达与肿瘤的大小、深度浸润、淋巴和静脉浸润、淋巴结转移和UICC分期呈正相关, MMP-2、MMP-9和VEGF在很大程度上促进胃癌血管生成和胃癌进展, 是胃癌不良预后因素.

创新盘点

目前关于环巴胺的抗肿瘤作用机制尚未明确. 本研究发现环巴胺对胃癌细胞MKN45具有明显的增殖抑制及促凋亡作用, 其机制可能与下调肿瘤侵袭转移相关基因VEGF、MMP-2、MMP-9的表达有关.

同行评价

本文研究环巴胺诱导胃癌MKN45细胞调亡的作用及其对VEGF、MMP-2、MMP-9基因表达的影响, 有一定的创新性, 条理清晰, 结论可靠, 有科学意义和学术价值.

备注

编辑: 田滢 电编: 鲁亚静

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