孤束核、脊髓损毁后艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠PGE2与EGF含量的影响

摘要

目的: 损毁大鼠中枢神经通路中的孤束核和脊髓, 观察艾灸预处理对胃黏膜内源性保护物质前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE₂)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)含量的影响, 进而探讨艾灸启动内源性保护信息与中枢神经通路的关系.

方法: 50只SD大鼠随机分5组, 即A: 空白对照组; B: 模型对照组; C: 温和灸+模型组; D: 温和灸+模型组+孤束核损毁组; E: 温和灸+模型组+脊髓损毁组. 预先按要求对D、E组大鼠分别实施孤束核、脊髓的损毁手术, 再对相应组别进行艾灸处理, 最后用无水酒精灌胃造成急性胃黏膜损伤模型. 运用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测胃黏膜组织中PGE₂和EGF的含量.

结果: 艾灸预处理有上调胃黏膜中PGE₂、EGF含量的作用(338.82 μg/L±19.87 μg/L vs 279.52 μg/L±16.53 μg/L, P<0.01; 4037.12 μg/L±300.20 μg/L vs 2923.73 μg/L±251.23 μg/L, P<0.05), 孤束核和脊髓被损毁的2组大鼠胃黏膜PGE₂和EGF的含量明显低于神经通路未损伤的温和灸组(298.65 μg/L±12.89 μg/L, 317.56 μg/L±16.60 μg/L vs 338.82 μg/L±19.87 μg/L; 3176.21 μg/L±242.35 μg/L, 3337.43 μg/L±249.86 μg/L vs 4037.12 μg/L±300.20 μg/L, 均P<0.01), 且孤束核损毁的大鼠胃黏膜中PGE₂的含量较脊髓损毁的低(P<0.05).

结论: 损毁大鼠中枢神经通路中的孤束核和脊髓对艾灸预处理提高胃黏膜组织中PGE₂、EGF含量有影响, 提示孤束核和脊髓均参与了艾灸保护胃黏膜信号的传导. 其中, 艾灸诱导胃黏膜PGE₂的产生可能主要受控于孤束核, 而其对胃黏膜EGF表达调控则与孤束核和脊髓均有关.

关键词: 艾灸预处理; 胃黏膜损伤; 足三里; 孤束核; 脊髓; 前列腺素E2; 表皮生长因子

核心提示: 本文从分析艾灸的防治作用入手, 进行中枢神经信息通路调控机制的研究, 通过损毁孤束核和切断脊髓, 观察艾灸预处理对大鼠胃黏膜内源性保护物质前列腺素E2(prostaglandin E2)、表皮生长因子(epidermal growth factor)含量的影响, 进而探讨艾灸启动内源性保护信息与中枢神经通路的关系.

Effect of moxibustion pretreatment on the contents of PGE₂ and EGF in gastric mucosal injury in rats after nucleus of the solitary tract or spinal cord damage

Zhou Yang, Guo-Shan Zhang, Mi Liu, Hai-Feng Zhang, Yi-Jun Lei, Xiao-Rong Chang, Bao-Sheng Yu

Zhou Yang, Mi Liu, Xiao-Rong Chang, College of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Hunan University of TCM, Changsha 410007, Hunan Province, China

Guo-Shan Zhang, Hai-Feng Zhang, Yi-Jun Lei, Hunan University of TCM, Changsha 410007, Hunan Province, China

Bao-Sheng Yu, College of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of TCM, Changsha 410007, Hunan Province, China

Supported by: the National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2009CB522904; the National Natural Science Foundation of China, No. 81173326; and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education, No. 20124323110001.

Correspondence to: Bao-Sheng Yu, Professor, College of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of TCM, 113 Shaoshan Middle Road, Changsha 410007, Hunan Province, China. ybs1955@126.com

Received: January 7, 2013
Revised: March 20, 2013
Accepted: May 15, 2013
Published online: June 8, 2013

Abstract

AIM: To observe the effect of moxibustion pretreatment on the contents of prostaglandin E2 (PGE₂) and epidermal growth factor (EGF) in acute gastric mucosal injury in rats after nucleus of the solitary tract (NTS) or spinal cord damage, and to discuss the relationship between the central nervous system and endogenous protective effect of moxibustion.

METHODS: Fifty SD rats were randomly divided into five groups: a blank group, a model group, a moxibustion group, a NTS damage group, and a spinal cord damage group. After spinal cord damage and NTS damage were induced in groups D and E, respectively, moxibustion at Zusanli point (ST36) was applied in groups C, D and E. After that, the rats were intragastrically given absolute ethanol to induce acute gastric mucosal injury. The contents of PGE₂ and EGF in the gastric mucosa were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

RESULTS: Moxibustion pretreatment increased the contents of PGE₂ and EGF in the gastric mucosa (338.82 μg/L ± 19.87 μg/L vs 279.52 μg/L ± 16.53 μg/L, P < 0.01; 4037.12 μg/L ± 300.20 μg/L vs 2923.73 μg/L ± 251.23 μg/L, P < 0.05). NTS or spinal cord damage reduced the contents of PGE₂ and EGF compared to the moxibustion group, in which the NTS and spinal cord were normal (298.65 μg/L ± 12.89 μg/L, 317.56 μg/L ± 16.60 μg/L vs 338.82 μg/L ± 19.87 μg/L; 3176.21 μg/L ± 242.35 μg/L, 3337.43 μg/L ± 249.86 μg/L vs 4037.12 μg/L ± 300.20 μg/L, all P < 0.01). The content of PGE₂ in the NTS damage group was lower than that in the spinal cord damage group (P < 0.05).

CONCLUSION: NTS or spinal cord damage reduces the protective effect of moxibustion pretreatment at Zusanli point (ST36) on the gastric mucosa, suggesting that both the NTS and spinal cord are involved in the protective effect of moxibustion on the gastric mucosa.

Key Words: Moxibustion pretreatment; Gastric mucosa injury; Zusanli point (ST36); Nucleus of the solitary tract; Spinal cord; Prostaglandin E2; Epidermal growth factor

0 引言

现代应激理论的研究[1-5]结果表明, 艾灸预处理可以激发机体适度应激, 诱导内源性保护物质的释放, 提高机体抗病与应变能力, 并产生减轻或阻抑随后疾病的损伤作用, 是一种既不损伤组织器官又能产生预防疾病效果的有效方法. 我们的前期研究显示, 艾灸预处理足三里等穴可在诱导机体产生相关内源性胃黏膜保护物质的同时, 一方面通过降低炎症反应、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用抗胃黏膜损伤; 另一方面启动了胃黏膜细胞增殖、胃黏膜重建等程序促进胃黏膜修复, 最终实现对胃黏膜的保护效应. 至于艾灸效应信息传递的具体通路, 以及如何通过神经、体液通路直接或间接地影响脏腑机能, 尤其是中枢神经系统对其调控的资料很少, 还有待进一步研究阐明. 本研究在损毁大鼠孤束核(nucleus of the solitary tract, NTS)和切断脊髓的前提条件下, 观察艾灸预处理对大鼠急性胃黏膜损伤保护因前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE₂)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)含量的影响, 从而进一步探讨艾灸启动的内源性保护信息对胃黏膜的保护效应与中枢神经通路的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

健康SD大鼠50只, 雌雄各半, 体质量220-250 g, 由湖南中医药大学动物实验中心提供(动物合格证号: SCXK<湘>2009-0004), 饲养温度20 ℃-25 ℃, 相对湿度50%-60%, 光线采用12 h/12 h昼夜变化. Φ4 mm温灸纯艾条(南阳汉医责任有限公司), 自制灸架. 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(SD), HRP goat anti-mouse IgG(Proteintech); BL-410生物信号处理系统(成都泰盟电子有限公司), TGL-16台式冷冻离心机(长沙湘仪天平仪器厂), W-960多功能全自动酶标洗板机、MB酶标仪(深圳汇松科技有限公司), DK-8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司).

1.2 方法

1.2.1 分组及处理: 按随机数字表法将50只大鼠分为5组, 每组10只动物, 即: A: 空白对照组; B: 模型对照组; C: 温和灸+模型组; D: 温和灸+模型组+孤束核损毁组; E: 温和灸+模型组+脊髓损毁组. 大鼠雌雄分笼饲养7 d, 以适应环境, 提高存活率; 7 d后, 按要求对D、E组大鼠分别实施脊髓、孤束核损毁手术, 并进行术后护理2 d, A、B、C组继续正常饲养2 d; 对A、B组进行捆绑假灸处理, C、D、E组进行捆绑艾灸处理, 共8 d; 处理第8天后, 各组禁食24 h, A组蒸馏水灌胃处理, B、C、D、E组无水乙醇灌胃造模; 造模24 h后, 腹腔注射20%乌拉坦0.6 mL/100 g麻醉, 取胃、脑组织进行指标检测和数据分析.

1.2.2 神经通路损毁方法: (1)孤束核电损毁[6,7]. 大鼠腹腔麻醉(20%乌拉坦, 0.6 mL/100 g), 俯卧固定在脑立体定位仪上, 头部备皮消毒. 使用直刃手术刀由两眼间至颅底沿头正中线切开, 露出颅骨, 标记前囟的位置. 在颅底距离前囟13-14 mm, 前正中线左右旁开1 mm处, 用电钻各开一个1×1 mm的骨窗, 定位参照Paxinos和Watson大鼠脑立体定位图谱[8], 将自制不锈钢绝缘损毁电极(直径0.35 mm, 尖端裸露0.5 mm), 匀速缓慢先后插入两侧的孤束核(AP: 13.2 mm, L/R: 0.9 mm, H: 7.7-7.8 mm). 损毁电极接BL-410生物信号处理系统输出端的正极, 负极夹于切口皮肤黏膜组织, 启动输出阳极直流电, 损毁参数为连续单电流, 强度1 mA, 频率50 Hz, 波宽0.5 ms, 持续30 s, 分别损毁双侧孤束核. 术毕, 缝合伤口. 术后动物肌肉注射青霉素钠每天16万U, 连续1 wk. 待艾灸、造模处理完成后, 取动物脑组织, 做病理切片, HE染色, 光镜下观察分析孤束核的形态, 以此判定孤束核损毁是否成功; (2)脊髓横断损毁[9-11]. 大鼠腹腔麻醉(20%乌拉坦, 0.6 mL/100 g), 俯卧固定在手术台上, 背部备皮消毒. 按肋骨确定椎体序列, 由T8至T12沿背部正中线切开, 暴露T9-11椎体棘突及双侧椎板. 骨钳剪除T10椎板, 充分暴露T10水平脊髓, 以弯头眼科镊轻轻挑起脊髓, 正中线切开硬膜后, 用尖锐刀片自脊髓后正中沟垂直插入, 向两侧横向切开, 并去除约2 mm以上脊髓组织, 动物即刻出现摆尾, 双下肢抽搐或尿失禁. 术毕, 缝合切口. 术后动物肌肉注射青霉素钠每天16万U, 连续1 wk. 人工辅助排空动物膀胱2次/d. 以T10段以下呈现弛缓性瘫痪、感觉消失和肌张力消失, 不能维持正常体温, 大便滞留, 膀胱不能排空为标准判定脊髓损毁成功.

1.2.3 腧穴定位: 参考李忠仁主编的《实验针灸学》[12], 采用常用动物穴位定位法及拟人对照法定位, 选取双侧的足三里穴, 位于大鼠膝关节后外侧, 在腓骨小头下约5 mm处.

1.2.4 施灸方法: 温和灸: 将大鼠俯卧捆缚于鼠板, 取穴定位剪毛, 将艾条固定在自制小型艾灸支架上, 对准穴位, 距离穴位约0.5 cm处点燃施灸, 灸处局部温度控制在42 ℃左右. 每次双侧穴位同灸, 30 min/d, 连续处理8 d.

1.2.5 造模方法[13]: 采用无水乙醇灌胃法, 造成急性胃黏膜损伤模型. 艾灸预处理8 d后禁食不禁水24 h, B、C、D、E各组按常规灌胃方法将无水乙醇灌入胃内1次, 剂量为0.6 mL/100 g, A组按同样方法操作灌入生理盐水, 剂量为0.6 mL/100 g.

1.2.6 指标检测: 用ELISA测定胃黏膜PGE₂、EGF的含量(检测单位: 长沙维尔生物技术有限公司).

统计学处理 所有数据均为计量资料, 以mean±SD表示, 用SPSS16.0软件进行处理. 经检验符合正态分布和方差齐性, 采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 多组间两两比较用LSD法.

2 结果

(1)与空白组相比, 模型组大鼠胃黏膜中EGF的含量显著增高(P<0.01), 表明无水乙醇灌胃后, 胃黏膜局部EGF表达增强; (2)与模型组相比, 经艾灸预处理的各组大鼠胃黏膜PGE₂和EGF的含量均有不同程度地升高(P<0.01, P<0.05), 表明艾灸足三里可提高胃黏膜损伤大鼠胃黏膜PGE₂和EGF的含量; (3)与温和灸组相比, 脊髓、孤束核被损毁的两组大鼠胃黏膜PGE₂和EGF的含量明显较低(P<0.01), 表明脊髓和孤束核参与了艾灸对大鼠胃黏膜组织中PGE₂和EGF表达的促进作用; (4)孤束核损毁的大鼠胃黏膜中PGE₂的含量较脊髓损毁的低(P<0.05)(表1).

表1 各组大鼠胃黏膜中PGE₂、EGF的比较 (n = 10, mean±SD, μg/L).

分组	PGE2	EGF
A组	279.89±18.08	2579.34±308.15
B组	279.52±16.53	2923.73±251.23b
C组	338.82±19.87bd	4037.12±300.20bd
D组	298.65±12.89ace	3176.21±242.35bce
E组	317.56±16.60bdef	3337.43±249.86bde

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs A组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs B组;

^fP<0.01 vs C组;

^eP<0.05 vs D组. A: 空白对照组; B: 模型对照组; C: 温和灸+模型组; D: 温和灸+模型组+孤束核损毁组; E: 温和灸+模型组+脊髓损毁组. PGE₂: 前列腺素E₂; EGF: 表皮生长因子.

3 讨论

中医理论认为, 人体的健康是以正气为基础的, 正气的盛衰在疾病发生与转归中起着决定性作用, 正如《内经》中所云"正气存内, 邪不可干......阴平阳秘, 精神乃治". 因此, 中医学在治疗方面十分注重扶正固本, 常通过扶助正气以提高机体抗病能力, 达到抵御病邪的目的. 这一传统观点与现代研究中的内源性保护机制有着密切联系, 二者都是通过机体的自主性调节或激发机体自身调节机制而产生适应性作用, 从而维持人体机能活动. 内源性保护机制是机体实现自我保护的一种重要机制, 其本质是适应性反应诱导了内源性保护物质的产生, 通过提高机体的适应能力和抗损伤能力, 维持机体内部的动态平衡. 他表明人体具有自身保护的能力, 具有适应环境刺激、增强自身对抗损伤的调控能力. 内源性保护物质在这一过程中充当了不可或缺的角色.

PGE₂为目前公认的一种内源性细胞保护因子, 他既能削弱损伤因子的作用, 又能增强黏膜抵抗力. EGF是一种具有抑制胃酸分泌, 促进上皮增殖, 组织修复和细胞保护作用的内源性物质, 是近年发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的分子. 二者不仅能够有效抑制胃酸、胃蛋白酶的分泌, 降低对黏膜的破坏, 而且PGE₂还可以增加黏膜局部血流, 促进蛋白合成和上皮再生, 介导适应性细胞保护作用, 促使已受损的胃黏膜修复[14-16], EGF则参与了黏膜上皮结构的重建, 对促进细胞内合成代谢、刺激细胞的迁移和增殖、加快上皮细胞的成熟有明显效果[17]. 因此, 无论是在保护胃黏膜免受损伤因子破坏方面, 还是在修复受损胃黏膜、维持胃肠黏膜完整性方面, PGE₂和EGF都起着非常关键的作用.

本实验在大鼠双侧孤束核损毁和T10水平脊髓切断的前提下, 观察艾灸预处理对大鼠急性胃黏膜损伤保护作用, 发现孤束核、脊髓损毁的两组大鼠胃黏膜中PGE₂、EGF的含量要明显低于神经通路未损毁的温和灸组, 二者的损毁不同程度地影响了艾灸对胃黏膜的保护作用, 说明孤束核和脊髓均是艾灸足三里保护胃黏膜信号传导的重要途径.

此外, 通过比较孤束核、脊髓损毁的两组大鼠之间艾灸预处理上调内源性保护物质的作用, 我们发现一方面孤束核损毁组大鼠胃黏膜组织中PGE₂的含量比脊髓切断组大鼠的低, 说明艾灸诱导胃黏膜中PGE₂的产生则可能主要受控于孤束核; 而另一方面, 在对EGF的含量的影响上两组大鼠无明显差异, 提示艾灸诱导胃黏膜中EGF的表达受到孤束核和脊髓的共同调控.

评论

背景资料

艾灸可通过多途径、多因素、多水平诱导机体产生内源性保护物质, 启动一系列抗炎、抗氧化、抑制凋亡等抗损伤和胃黏膜细胞增殖及胃黏膜重建等保护效应. 但艾灸实现对内源性保护物质调控的信息传递通路及其与中枢神经系统的关系尚不明确.

同行评议者

王富春, 教授, 长春中医药大学

研发前沿

大量研究证实, 胃黏膜的内源性保护因子具有扩张血管, 改善胃黏膜供血, 保护、提高血管内皮细胞和胃上皮细胞功能等作用, 尤其是在致损伤因子存在的情况下, 发挥着重要的胃黏膜保护作用, 如前列腺素2(prostaglandin E2, PGE₂)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等.

相关报道

电损毁孤束核后, 电针足三里穴对应激性胃黏膜损伤的保护作用减弱, 证实孤束核参与了电针足三里穴抗应激性胃溃疡的作用过程.

创新盘点

在损毁中枢神经系统中的孤束核和脊髓的前提下, 运用艾灸预处理足三里穴, 通过比较各组大鼠胃黏膜中PGE₂与EGF的含量, 表明孤束核和脊髓对于艾灸调控PGE₂、EGF具有不同程度的作用.

应用要点

本文通过探讨艾灸预处理对急性胃黏膜损伤保护作用的中枢机制, 证实了艾灸对于内源性保护物质的调控与孤束核、脊髓均存在必然的联系, 为阐明艾灸保护胃黏膜损伤的作用机制提供理论基础.

名词解释

NTS: 位于延髓背侧部, 是脑干内接受腹腔内脏感觉传入信息的主要核团, 在调节内脏器官活动中有重要作用. NTS既接受来自内脏的各种机械和化学信号及伤害性刺激, 同时还接受来自躯体部位的感觉传入信息, 艾灸和针刺的躯体感觉传入和内脏伤害性刺激传入可能在NTS发生汇聚, 并通过NTS神经元的整合后影响内脏的功能.

同行评价

本文通过动物实验说明孤束核和脊髓均是艾灸足三里保护胃黏膜信号传导的重要途径, 从一个侧面阐释了艾灸防治疾病的机制, 具有较强的学术价值, 并对于进一步全面深入的揭示艾灸的作用机制具有积极的意义.

备注

编辑: 李军亮 电编: 闫晋利

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