临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-12-08; 20(34): 3305-3309
在线出版日期: 2012-12-08. doi: 10.11569/wcjd.v20.i34.3305
Klotho与β-Catenin在食管癌组织中的表达及临床意义
汤小伟, 黄曙, 王敏, 季国忠, 范志宁
汤小伟, 黄曙, 王敏, 季国忠, 范志宁, 南京医科大学第二附属医院消化医学中心 南京医科大学消化内镜研究所 江苏省南京市 210011
汤小伟, 在读硕士, 主要从事消化系肿瘤的分子机制研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 81001076.
作者贡献分布: 此课题由汤小伟、黄曙及范志宁设计; 研究过程及统计分析由汤小伟、黄曙、王敏及季国忠完成; 本论文由汤小伟、黄曙及范志宁总结成文.
通讯作者: 范志宁, 教授, 主任医师, 210011, 江苏省南京市姜家园路121号, 南京医科大学第二附属医院消化医学中心, 南京医科大学消化内镜研究所. fanzhining@hotmail.com
电话: 025-58509996
收稿日期: 2012-09-15
修回日期: 2012-10-27
接受日期: 2012-11-09
在线出版日期: 2012-12-08

目的: 研究Klotho与β-Catenin蛋白在食管癌与癌旁组织中的表达及其与临床病理特征的关系.

方法: 采用免疫组织化学EnVision二步法, 检测Klotho与β-Catenin蛋白在75对食管鳞状细胞癌与其癌旁组织芯片中的表达情况, 并结合临床病理资料进行统计分析.

结果: Klotho在食管癌中表达的阳性率明显低于癌旁组织(14.9% vs 63.4%, P<0.05), Klotho的表达与TNM分期、浸润深度明显相关(均P<0.05). β-Catenin在食管癌中表达的阳性率明显高于癌旁组织(80.0% vs 16.4%, P<0.05), β-Catenin的表达与淋巴结转移、TNM分期明显相关(均P<0.05). Klotho与β-Catenin在食管癌中的表达成负向关(r = -0.276, P<0.05).

结论: Klotho与β-Catenin在食管鳞状细胞癌与癌旁组织中的表达阳性率不同, 差异均具有显著性, 联合检测癌组织中Klotho与β-Catenin的表达可为食管癌的进展与预后提供重要的参考依据.

关键词: 食管鳞状细胞癌; 组织芯片; Klotho基因; β-Catenin蛋白
引文著录: 汤小伟, 黄曙, 王敏, 季国忠, 范志宁. Klotho与β-Catenin在食管癌组织中的表达及临床意义. 世界华人消化杂志 2012; 20(34): 3305-3309
Clinical significance of expression of Klotho and β-Catenin in esophageal squamous cell carcinoma
Xiao-Wei Tang, Shu Huang, Min Wang, Guo-Zhong Ji, Zhi-Ning Fan
Xiao-Wei Tang, Shu Huang, Min Wang, Guo-Zhong Ji, Zhi-Ning Fan, Institute of Digestive Endoscopy; Medical Center for Digestive Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81001076.
Correspondence to: Zhi-Ning Fan, Professor, Chief Physician, Institute of Digestive Endoscopy; Medical Center for Digestive Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China. fanzhining@hotmail.com
Received: September 15, 2012
Revised: October 27, 2012
Accepted: November 9, 2012
Published online: December 8, 2012

AIM: To investigate the clinical significance of expression of Klotho and β-Catenin in esophageal carcinoma.

METHODS: Tissue microarray technique and immunohistochemistry were used to examine Klotho and β-Catenin expression in 75 esophageal carcinoma tissue specimens and matched tumor-adjacent esophageal tissue. Correlations between Klotho and β-Catenin expression and clinical and pathological features were then analyzed.

RESULTS: The positive rate of Klotho expression was significantly lower in esophageal carcinoma tissue than in tumor-adjacent tissue (14.9% vs 63.4%, P < 0.05). The expression of Klotho was correlated with tumor invasion and clinical stage (both P < 0.05). The positive rate of β-Catenin expression was significantly higher in esophageal carcinoma tissue than in tumor-adjacent tissue (80.0% vs 16.4%, P < 0.05). The expression of Klotho was correlated with lymph node metastasis and tumor clinical stage (r = -0.276, P < 0.05).

CONCLUSION: The positive rates of Klotho and β-Catenin expression differed significantly between esophageal carcinoma and tumor-adjacent tissue. Klotho and β-Catenin may be used as important markers for esophageal carcinoma and are helpful for prognosis prediction in esophageal carcinoma.

Key Words: Esophageal squamous cell carcinoma; Tissue microarray; Klotho; β-Catenin
0 引言

食管癌是临床最常见的恶性肿瘤之一, 居全球癌症死亡原因的第5位[1]. 对食管癌发生发展的分子机制研究对阐明食管癌发生机制、筛查高风险人群、判断预后及食管癌的基因治疗均具有重要的意义. Klotho是1997年发现与衰老相关的基因[2]. 近年来, 一些学者报道了Klotho在乳腺癌、肺癌、胰腺癌与结肠癌等中具有抑制肿瘤细胞生长与转移, 促进肿瘤细胞凋亡等功能[3]. 而β-Catenin作为Wnt通路中重要的信号分子, 已有研究证实了他与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[4-8]. 但是Klotho与β-Catenin在食管癌中相互作用未见有相关报道. 本研究利用免疫组织化学EnVision二步法检测Klotho与β-Catenin在食管癌与癌旁组织芯片中的表达情况, 探讨食管癌组织中Klotho与β-Catenin的表达与食管癌临床病理特征的关系以及2者的相关性.

1 材料和方法
1.1 材料

食管鳞状细胞癌组织芯片为上海芯超生物技术有限公司产品(编号HEso-Squ150CS-01), 每例芯片的直径为1.5 mm, 厚度为4 μm, 10×16双芯排列, 用统一标准的方法加工[9]. 每片芯片的完整性>95%. 在75例标本中, 男47例, 女18例; 年龄41-81岁, 中位年龄60岁. 参照2000年世界卫生组织推荐的肿瘤分化分级标准, 低分化鳞癌57例, 中、高分化鳞癌18例. 按2002年国际抗癌联盟TNM分期法, Ⅰ期11例, Ⅱ期27例, Ⅲ期27例, Ⅳ期10例. 一抗山羊抗人Klotho与β-Catenin多克隆抗体和相应二抗均购自Santa Cruz公司(产品编号分别为sc-22218和sc-2020), -20 ℃保存, 一抗工作浓度为4 μg/mL. 即用型免疫组织化学EnVision二步法试剂盒购自基因有限公司.

1.2 方法

采用免疫组织化学EnVision二步法检测Klotho与β-Catenin蛋白表达情况. 用已知阳性组织切片作阳性对照, 以PBS代替一抗作阴性对照, 按试剂盒说明书进行操作. 结果判定: 据染色强度与阳性细胞比例综合计分, 细胞的染色强度可分为0分(染色阴性), 1分(淡黄色颗粒), 2分(棕黄色颗粒), 3分(褐色颗粒); 阳性细胞比例的评分方法为: 0分(阳性细胞比例≤5%), 1分(5%<阳性细胞比例≤25%), 2分(25%<阳性细胞比例≤50%), 3分(50%<阳性细胞比例≤75%), 4分(75%<阳性细胞比例≤100%). 根据2项乘积的分数分为4级, 分数≤4记为-, 4<分数≤8记为+, 8<分数≤12记为++, 分数>12记为+++. 其中-记为Klotho与β-Catenin表达阴性; +, ++, +++记为Klotho与β-Catenin表达阳性.

统计学处理 采用Spss13.0统计软件进行分析. Klotho与β-Catenin蛋白在食管癌与癌旁组织中表达差异, 以及Klotho与β-Catenin与临床病理特标(性别、年龄、食管癌临床分期、病理分级、淋巴结转移、浸润深度等)的关系采用χ2检验. Klotho与β-Catenin表达阳性率的相互关系采用Spearman等级相关分析, P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结果
2.1 组织芯片的质量

组织芯片经免疫组织化学染色后, 光镜下剔除染色效果差, 组织残缺不全的标本, 最后进入统计检测Klotho表达的组织芯片含74例食管癌组织与71例癌旁组织. 检测β-Catenin表达的组织芯片含75例食管癌组织与67例癌旁组织.

2.2 Klotho与β-Catenin蛋白在食管癌与癌旁组织中的表达

74例食管癌组织中11例Klotho表达阳性(14.9%), 显色部位主要为细胞浆, 63例Klotho表达阴性(85.1%, 图1A). 71例癌旁组织中45例Klotho表达阳性(63.4%, 图1B), 26例Klotho表达阴性(36.6%). 75例食管癌组织中60例β-Catenin表达阳性(80.0%, 图2A), 显色部位主要为细胞浆, 15例β-Catenin表达阴性(20.0%). 67例癌旁组织中11例β-Catenin表达阳性(16.4%), 56例β-Catenin表达阴性(83.6%, 图2B). 经分析Klotho与β-Catenin蛋白在食管癌与癌旁组织中表达差异均有统计学意义(均P<0.05, 表1).

表1 Klotho与β-Catenin在食管癌与癌旁组织中的表达.
Klotho
β-Catenin
阳性(%)阴性P值阳性(%)阴性P值
癌组织11(14.9)630.00060(80.0)150.000
癌旁组织45(63.4)2611(16.4)56
图1
图1 免疫组织化学EnVision二步法检测食管鳞癌及其癌旁组织中Klotho蛋白的表达(×200). A: 食管癌组织中呈阴性表达; B: 癌旁组织中呈阳性表达.
图2
图2 免疫组织化学EnVision二步法检测食管鳞癌及其癌旁组织中β-Catenin蛋白的表达(×200). A: 食管癌组织中呈阴性表达; B: 癌旁组织中呈阳性表达.
2.3 Klotho与β-Catenin蛋白表达与食管癌临床病理特征的关系

Klotho表达阳性与食管癌患者性别、年龄、病理分级、淋巴结转移无统计学意义, 而与临床分期、浸润深度有密切关系(均P<0.05). β-Catenin表达阳性与食管癌患者性别、年龄、病理分级、浸润深度无统计学意义, 而与临床分期、淋巴结转移有密切关系(P<0.05, 表2).

表2 Klotho与β-Catenin在癌组织中的表达与患者临床病理特征的关系.
临床病理特征Klotho
β-Catenin
阳性 n(%)阴性P值阳性 n(%)阴性P值
性别
男7(63.4)490.46848(81.4)80.055
女4(36.4)1311(18.6)7
年龄(岁)
>607(63.4)320.46131(52.5)80.956
<604(36.4)3028(47.5)7
浸润深度
未侵及外膜9(81.8)290.04629(50.0)100.078
侵犯到外膜2(18.2)3029(50.0)3
病理分级
Ⅰ级, Ⅱ级10(90.9)470.42544(73.3)140.190
Ⅱ--Ⅲ级,Ⅲ级1(9.1)1616(26.7)1
淋巴结转移
无8(72.7)280.09225(42.4)110.032
有3(27.3)3434(57.6)4
TNM分期
1期+2期9(81.8)280.02227(45.0)110.050
3期+4期2(18.2)3533(55.0)4
2.4 Klotho与β-Catenin蛋白在食管癌组织表达的相关性

Spearman等级相关分析表明Klotho与β-Catenin之间表达存在相关性(r = -0.276, P<0.05, 表3).

表3 Klotho与β-Catenin在食管癌组织中表达的相关性.
β-Catenin
合计
阳性阴性
Klotho阳性448
阴性561066
合计601474
采用Spearman等级相关分析法: 相关系数r = -0.276, P = 0.017.
3 讨论

Klotho基因于1997年被发现, 最先的研究认为他是一种抗衰老基因, Klotho敲除的老鼠表现出一系列衰老的症状, 如骨质疏松、肺气肿、皮肤萎缩、动脉硬化等[10-16]. 近年来对Klotho的功能研究提示其与恶性肿瘤的发生发展密切相关[17-30]. Lee等[21]将宫颈癌细胞成功转染Klotho基因后, 发现癌细胞的生长明显受限, 凋亡率明显增加, 细胞内的Wnt通路重要的信号分子β-Catenin含量明显减少, c-myc与CCND1明显降低. Wnt/β-Catenin通路已被研究证实在多种恶性肿瘤的发生发展中起促进作用, β-Catenin是该通路中重要的信号分子, Veeramachaneni等[8]研究发现下调β-Catenin的表达能显著抑制食管癌细胞的生长.

本实验通过组织芯片联合免疫组织化学EnVision二步法检测了食管鳞癌及癌旁正常组织中Klotho与β-Catenin蛋白的表达情况, 结果表明食管癌中的Klotho的表达低于癌旁组织, β-Catenin的表达高于癌旁; Klotho的表达还与食管癌的浸润深度、临床分期密切相关, 随着食管癌浸润的加深、临床分期的增高, Klotho的表达阳性率降低. β-Catenin蛋白的表达与食管癌的淋巴结转移、临床分期密切相关, 随着食管癌发生淋巴结转移、临床分级增高, β-Catenin的表达阳性率升高. 这些结果提示食管癌的发生与Klotho的低表达有关, Klotho可能作为一肿瘤抑制因子参与食管癌的进展过程; 而食管癌的发生发展与β-Catenin的高表达有关, β-Catenin可以作为食管癌的促进因子. 并且Klotho与β-Catenin在食管癌组织中表达阳性率的相关分析发现呈负相关, 进一步提示2者在食管癌发生中起着相反的作用, Klotho的低表达与β-Catenin的高表达共同参与了食管癌的发生发展.

综上所述, Klotho在食管癌中低表达, 与食管癌的浸润深度、临床分期密切相关. β-Catenin蛋白在食管癌中高表达, 与食管癌的淋巴结转移、临床分期密切相关. 2者可作为判断食管癌预后的指标, 但Klotho与β-Catenin在食管癌发生发展中相互作用的具体分子机制还需进一步研究.

评论
背景资料

食管癌是临床最常见的恶性肿瘤之一, 居全球癌症死亡原因的第5位. Klotho是1997年发现与衰老相关的基因. 近年来, 一些学者报道了Klotho在乳腺癌、肺癌、胰腺癌与结肠癌等中具有抑制肿瘤细胞生长与转移, 促进肿瘤细胞凋亡等功能.

同行评议者

陈洪, 副教授, 主任医师, 东南大学附属中大医院消化科

研发前沿

目前, Wnt信号通路的激活在多种恶性肿瘤的发生发展中起重要作用. β-Catenin作为Wnt通路中重要的信号分子, 已有研究证实了他与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关. 但是未见Klotho与β-Catenin在食管癌中相互作用的相关报道.

相关报道

多项研究已经表明Wnt/β-Catenin信号通路的激活在多种恶性肿瘤的发生发展中起重要作用. Lee等将宫颈癌细胞成功转染Klotho基因后, 发现癌细胞的生长明显受限, 凋亡率明显增加, 细胞内的Wnt通路重要的信号分子β-Catenin含量明显减少, 促进细胞增殖的分子c-myc与CCND1明显降低.

创新盘点

本研究报道了Klotho在食管癌中低表达, 与食管癌的浸润深度、临床分期密切相关. β-Catenin蛋白在食管癌中高表达, 与食管癌的淋巴结转移、临床分期密切相关. Klotho在食管癌的发生发展中起抑制作用, 并且在食管癌中Klotho的表达与β-Catenin的表达呈负相关.

应用要点

Klotho与β-Catenin的表达量可作为判断食管癌预后的指标. 但Klotho与β-Catenin在食管癌发生发展中相互作用的具体分子机制还需进一步研究.

名词解释

组织芯片: 也称组织微阵列(tissue microarrays), 是生物芯片技术的一个重要分支, 是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上, 进行同一指标的原位组织学研究. 组织芯片技术可以与其他很多常规技术如免疫组织化学(IHC)、核酸原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、原位PCR等结合应用, 检测一种或多种分子的表达情况等.

同行评价

Klotho与结肠癌等肿瘤的关系已受关注, 其与β-Catenin在食管癌发生发展中相互作用的关系未见报道. 本文具有较好的创新性.

编辑:翟欢欢 电编:闫晋利

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