Oncoprotein 18在肝癌侵袭转移过程中的作用

摘要

目的: 探讨原癌蛋白18(Oncoprotein 18, Op18)在肝癌侵袭转移过程中的作用机制.

方法: 采用RNA干扰, 抑制人肝癌细胞HCCLM3中Op18的表达, RT-PCR和Western blot评价干扰效率; 通过细胞粘附分析、体外Transwell分析法检测Op18表达缺失后对HCCLM3细胞粘附、运动和侵袭能力的改变; RT-PCR和免疫组织化学分别在48例未伴转移的肝癌组织和48例伴转移的肝癌组织中解析Op18表达与肝癌侵袭转移的关系.

结果: RT-PCR和Western blot结果显示: 在HCCLM3细胞中行RNAi后Op18表达被有效抑制, 抑制率达到80%以上; Op18表达缺失后, 在不同时间点(20、40和60 min)实验组细胞粘附能力(0.616±0.057、0.740±0.0713和1.001±0.083)较阴性对照组(0.944±0.068、1.196±0.115和1.441±0.053)明显下降(P<0.05); Transwell实验结果提示: 经RNAi后实验组细胞运动、侵袭能力(运动: 0.145±0.011, 侵袭0.127±0.008)较阴性对照组(运动: 0.206±0.008, 侵袭: 0.168±0.012)显著降低(P<0.01); 分别在伴转移和未伴转移的肝癌组织中检测Op18的表达, RT-PCR(Op18与GAPDH相对比值: 0.560±0.128 vs 0.414±0.086)和IHC(积分吸光度值为: 624.771±100.032 vs 413.786±71.833)实验结果均提示Op18在伴转移的肝癌组织中的表达更高(P<0.01).

结论: Op18在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用.

关键词: 肝细胞癌; 原癌蛋白18; RNA干扰; 侵袭

Role of Oncoprotein 18 in metastasis of hepatocellular carcinoma

Lin Gan, Cheng-Gang Duan, Shu Gong, Kun Guo, Hong Shu, Yin-Kun Liu

Lin Gan, Cheng-Gang Duan, Shu Gong, the Research Centre for Preclinical Medicine, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Kun Guo, Hong Shu, Yin-Kun Liu, Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Supported by: the National Science and Technology Key Project, No. 2008ZX10002-021.

Correspondence to: Yin-Kun Liu, Professor, Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, 180 Fenglin Road, Shanghai 20032, China. liu.yinkun@zs-hospital.sh.cn

Received: May 3, 2012
Revised: June 3, 2012
Accepted: August 7, 2012
Published online: August 18, 2012

Abstract

AIM: To explore the role of Oncoprotein 18 (Op18) in metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC).

METHODS: Op18 expression was repressed in HCCLM3 cells by RNA interference, and interference effect was evaluated by RT-PCR and Western blot. Cell adhesion, migration and invasion were analyzed by cell adhesion assay and Transwell assay in vitro. Op18 expression was detected by RT-PCR and immunohistochemistry in 96 HCC specimens with or without metastasis.

RESULTS: Op18 expression was effectively inhibited by RNA interference in HCCLM3 cells. Cell adhesion was significantly suppressed in the RNAi group compared to the mock group (20 min: 0.616 ± 0.057 vs 0.944 ± 0.068; 40 min: 0.740 ± 0.0713 vs 1.196 ± 0.115; 60 min: 1.001 ± 0.083 vs 1.441 ± 0.053; all P < 0.05). Transwell assay revealed that cell migration and invasion decreased in the RNAi group compared to the mock group (migration: 0.145 ± 0.011 vs 0.206 ± 0.008; invasion: 0.127 ± 0.008 vs 0.168 ± 0.012; both P < 0.01). Op18 expression was detected in 96 HCC tissues with or without metastasis. RT-PCR demonstrated that Op18 was overexpressed in HCC tissues with metastasis (n = 48) compared with HCC tissues without metastasis (n = 48, Op18/GAPDH relative ratio: 0.560 ± 0.128 vs 0.414 ± 0.086); and IHC results also indicated that Op18 expression was up-regulated in HCC tissues with metastasis in comparison with HCC tissues without metastasis (integrated density: 624.771 ± 100.032 vs 413.786 ± 71.833, P < 0.01).

CONCLUSION: Overexpression of Op18 may play an important role in HCC metastasis.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; Oncoprotein 18; RNA interference; Metastasis

0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤, 死亡率在我国恶性肿瘤中居第2位, 其高转移高复发是导致死亡率居高不下的主要原因[1-4]. 原癌蛋白18(Oncoprotein 18, Op18), 也称Op17、Op19、stathmin等, 是一种重要的微管解离蛋白, 参与微管二聚体的形成[5-7]. 本研究采用RNA干扰技术, 在HCCLM3细胞中抑制Op18的表达后, 观察Op18表达缺失对HCCLM3细胞粘附、侵袭和运动能力的影响; 并进一步在伴转移和未伴转移的肝癌组织中探讨Op18表达与肝癌侵袭转移的关系, 解析Op18在肝癌侵袭转移过程中发挥的作用.

1 材料与方法

1.1 材料

人HCCLM3肝癌细胞由复旦大学肝癌研究所建系; 所有HCC组织标本(广西医科大学附属第一人民医院, 2004-01/2004-12)均经术后病理检查证实, 其中伴转移肝癌(由病理和临床检查证实患者在肝外存在源于肝癌细胞的转移病灶)和未伴转移的肝癌组织各48例; TRIzol和lipofectamine^TM 2000均购自美国Invotrogene公司; 逆转录试剂盒购自Promega公司; 半定量PCR试剂盒购自莱枫生化; 增强化学发光试剂盒购自美国Pierce公司; Op18单抗购自ABcam公司; GAPDH抗体购自上海KANGCHEN; Transwell孔板购自美国Costa公司.

1.2 方法

1.2.1 小干扰(small interference, si)RNA序列的设计和合成: 人Op18基因的siRNA由上海吉凯公司设计合成. Op18 siRNA正义链: 5'-GAA ACG AGA GCA CGA GAA Att-3', 反义链: 5'-UUU CUC GUG CUC UCG UUU Ctt-3'; 阴性对照双链小RNA正义链: 5'- UUC UCC GAA CGU GUC ACG Utt-3', 反义链: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA Att-3'.

1.2.2 细胞培养、转染和干扰效率的鉴定: 方法如前所示, 详见文献[8], 即人肝癌细胞HCCLM3在含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中, 置37 ℃、50 mL/L CO₂的细胞培养箱内培养; 消化计数后按3×10⁵个/孔接种于6孔板; 至细胞融合率达60%左右, 按lipofectamine^TM 2000试剂说明书进行转染, 以80 nmol/L Op18 siRNA转染HCCLM3细胞48 h, 收集细胞检测RNA和蛋白质表达, 鉴定Op18干扰效率. 设转染Op18 siRNA的为实验组, 设转染非编码序列双链小RNA为阴性对照组, 设不作转染的为空白对照组.

1.2.3 细胞粘附实验: 用FN(20 μg/mL)包埋96孔板, 置37 ℃、50 mL/L CO₂孵箱中放置1 h. 分别将RNA干扰实验组、空白对照组和阴性对照组细胞(每组各设3个复孔)消化计数, 按2×10⁴细胞/孔加入孔板, 37 ℃分别培养20、40、60 min后40g/L多聚甲醛固定10 min; 龙胆紫染色15 min; 加入龙胆紫溶解液37 ℃温育30 min, 用酶标仪检测其A₅₄₀.

1.2.4 体外Transwell分析: 侵袭实验先在Transwell侵袭上室中用1 mg/mL Matrigel基质铺板, 置37 ℃、50 mL/L CO₂孵箱中培养6 h. 将Op18 RNA干扰的实验组、空白对照组和阴性对照组细胞(每组各设3个复孔)按1×10⁵细胞/孔加入上室. 同时在Transwell孔板的下室中加入600 μL含20% FBS的培养基. 培养30 h弃去上室细胞培养液, 拭净上室细胞. 4%多聚甲醛固定, 结晶紫染色15 min, 33%醋酸脱去染液, 用酶标仪测定A₅₇₀. 运动实验除Transwell侵袭上室不用Matrigel基质包被外, 其余步骤同侵袭实验.

1.2.5 RT-PCR: TRIzol试剂提取肝癌组织的RNA, 测定RNA浓度行逆转录. PCR扩增Op18基因和内参. 引物序列如下, Op18基因: 正义链5'-ATGAGGCAAACCCTGTGAAC-3', 反义链5'-AGCTTGGCACAGATCCTTGT-3'(158 bp); GAPDH正义链为5'-ATGACCCCTTCATTGACC-3', 反义链为5'-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3'(131 bp). PCR反应条件: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共30个循环. 2%琼脂糖电泳分离, 观察结果.

1.2.6 免疫组织化学: 将HCC石蜡切片烤片脱蜡, 微波抗原修复10 min, 5%山羊血清封闭1 h, 加入Op18抗体(1:200)4 ℃过夜, 二抗室温孵育30 min. DAB显色, 苏木精复染、脱水、封片. 并用ImagePro Plus 6.0(IPP)软件分析结果.

统计学处理 所有统计分析应用SPSS13.0软件进行. 数据用mean±SD表示, 均数两两比较应用配对t检验, 多样本均数比较采用单因素方差分析. P<0.05视差异有统计学意义.

2 结果

2.1 RNAi抑制HCCLM3细胞中Op18的表达

选择高表达Op18的人肝癌细胞株HCCLM3中行Op18的siRNA干扰. 转染siRNA 48 h后分别提取空白对照组、阴性对照组和RNAi实验组细胞的总RNA和蛋白质, 用RT-PCR和Western blot检测Op18的表达. RT-PCR结果显示在空白对照组、阴性对照组和实验组细胞中Op18与GAPDH的相对表达量分别为0.568±0.045、0.579±0.038、0.199±0.022, 与PCR结果相似, WB结果显示在空白对照组、阴性对照组和实验组细胞中Op18与GAPDH蛋白相对表达量为0.841±0.048、0.887±0.078、0.154±0.016. 以上结果提示: 无论是RNA水平还是蛋白质水平, RNAi都能明显抑制HCCLM3实验组细胞中Op18表达(P<0.01), 干扰率达到80%以上; 而空白对照组和阴性对照组之间没有统计学差异(图1).

图1 RNA干扰后HCCLM3肝癌细胞水平的表达. A: Op18 RNA; B: 蛋白质; 1: 空白对照组; 2: 阴性对照组; 3: 实验组.

2.2 Op18表达缺失抑制HCCLM3的细胞粘附

在HCCLM3细胞中行RNA干扰后, 收集空白对照组、阴性对照组和实验组细胞, 计数后铺入96孔板中, 分别在不同时间点(20、40和60 min)检测细胞粘附能力. 实验发现: 与3个时间点阴性对照组细胞粘附(0.944±0.068、1.196±0.115、1.441±0.053)相比较, 实验组细胞粘附能力(0.616±0.057、0.740±0.0713、1.001±0.083)降低(P<0.05); 而空白对照组和阴性对照组之间没有明显统计学差异(图2).

图2 HCCLM3细胞中RNA干扰抑制细胞粘附. 1: 空白对照组; 2: 阴性对照组; 3: 实验组在不同时间点(20、40和60 min)的细胞粘附, 发现与阴性对照组相比较, 实验组细胞的粘附明显降低.

2.3 Op18的RNAi可显著抑制HCCLM3细胞运动侵袭能力

在HCCLM3细胞中行RNA干扰后, 采用Transwell实验检测RNAi对HCCLM3细胞侵袭、运动的影响. 运动实验的结果发现与空白对照组和阴性对照组(0.208±0.01、0.206±0.008)相比较, RNAi实验组细胞的运动能力明显降低(0.145±0.011, P<0.01), 而空白对照与阴性对照之间没有差异. 侵袭实验结果与运动实验一致, 和空白组与阴性对照组相比较(0.163±0.019、0.168±0.012), RNAi后实验组细胞的侵袭能力(0.127±0.008)也被显著抑制(P<0.01, 图3).

图3 Op18表达缺失对HCCLM3细胞运动侵袭能力的影响. 1: 空白对照组; 2: 阴性对照组; 3: 实验组采用Transwell实验分别检测各组别HCCLM3肝癌细胞运动侵袭变化, 发现和阴性对照组相比较, 实验组细胞的侵袭运动明显降低.

2.4 肝癌组织(未伴转移和伴转移)中Op18的表达

采用RT-PCR分别检测10例未伴转移肝癌和10例伴转移肝癌组织中Op18的表达, 发现伴转移的肝癌组织中Op18表达更高(Op18/GAPDH: 0.560±0.128 vs 0.414±0.086), 二者具有统计学意义(P<0.01, 图4A). 另采用免疫组织化学的方法在肝癌组织(未伴转移肝癌和伴转移肝癌各48例)的石蜡切片中检测Op18的表达, 以细胞胞浆中出现棕褐色的颗粒为阳性. IPP软件系统分析免疫组化结果, 计算阳性区域的积分光密度. 发现伴转移的肝癌组织中Op18表达更高(积分光密度为624.771±100.032 vs 413.786±71.833). 用SPSS13.0分析发现: Op18在未伴转移和伴转移的肝癌组织中表达具有显著的差异(P<0.01, 图4B).

图4 伴转移的肝癌组织中Op18的表达明显增强. A: RT-PCR检测未转移肝癌和转移肝癌组织中Op18的表达直方图; B: 免疫组织化学检测未转移肝癌和转移肝癌组织中Op18的表达的直方图.

3 讨论

肝癌是我国最常见的高致死率的恶性肿瘤, 目前尚缺乏敏感高效的HCC转移复发的分子标志物, 其发病机制仍不清楚[9]. 提示探讨HCC侵袭转移的分子机制, 对降低肝癌患者的转移率和复发率, 提高患者的生存率和预后具有重要临床和现实意义.

Op18是重要的微管解离蛋白, 主要通过结合微管蛋白二聚体, 参与微管稳态平衡的维持、纺锤体和极体的形成分离、细胞分裂运动等多种细胞生物过程, 并作为信号传导因子在信号通路中发挥重要作用[10-13]. 研究发现在乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、白血病等多种肿瘤中Op18蛋白高表达, 提示Op18的表达可能参与了肿瘤的发生, 可作为肿瘤辅助诊断、治疗分子标志物和药物靶点[14-18]. 而本小组前期实验也发现在HCC组织中Op18高表达, 提示Op18与肝癌的发生相关, 这和Kung小组的实验结果一致[19,20]. 但是Op18是否参与肝癌的侵袭转移过程, 目前尚不清楚, 有待进一步研究.

我们在高表达Op18的人肝癌细胞HCCLM3中, 通过RNA干扰的方法, 使Op18的表达缺失后发现: Op18的表达抑制可明显抑制HCCLM3的粘附、运动和侵袭能力. 在2002年Ozon小组第一次报道在果蝇中如果降低Op18的表达能抑制精子的运动, 另有多个研究都发现在直肠癌、子宫内膜癌等多种属多类型细胞中stathmin的表达可以增加细胞的运动, 改变细胞的形态, 参与肿瘤的侵袭运动等[21-24]. 这些研究都支持我们的实验结果, 即Op18的表达缺失的确可以抑制肿瘤细胞的侵袭、运动. 我们在细胞实验的基础上, 进一步在肝癌组织检测Op18的表达, 验证我们假设, 即Op18在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用. 选择未转移的肝癌组织和伴转移的肝癌组织各48例, 用PCR和IHC的方法检测Op18的表达. 实验显示无论是mRNA水平还是蛋白质水平, Op18在伴转移的肝癌组织中表达显著增高, 提示Op18的表达可能预示肝癌的侵袭转移. Kasper小组在前列腺肿瘤组织中研究Op18表达时发现: 较未转移的前列腺肿瘤组织, Op18在转移、复发的肿瘤中表达更高, 且Op18的表达上调与肿瘤体积大小、病理分级、血管侵犯、肝内播散和5年生存率密切相关, 暗示Op18可能与肿瘤的发展过程有关; Mikihiro小组报道Op18的高表达与滋层细胞的转移侵袭相关; 同时在乳腺癌、内分泌肿瘤和卵巢癌等组织中实验也发现了相似的结果[17,25-29]. 这些研究都与我们的实验结果相吻合, 即Op18的高表达可能与肿瘤的发展过程相关, 能预示肿瘤的侵袭、转移, 成为肝癌转移的一个潜在诊断标志物.

Baldassarre小组进一步探讨了Op18参与肿瘤运动侵袭的分子机制, 研究发现Op18能与胞浆中的p27skip(一个细胞素依赖性蛋白激酶)相结合后, 失去解离微管的能力, 从而抑制肉瘤细胞HT-1080的侵袭运动能力. 还有研究发现鸟苷磷酸酶PhoA、Stat3也能结合Op18, 直接或者间接调节微管的动态变化, 最终通过对微管动态平衡的调节发挥对细胞的运动能力的重要作

用[30,31]. 这些都可能提示了Op18参与肿瘤侵袭转移的分子机制.

总之, 本研究从细胞和组织标本中都发现Op18表达上调参与肝癌的侵袭转移过程, 在肝癌发展过程中发挥重要作用. 但是, Op18是否能作为一个新的诊断肝癌侵袭转移、预测肝癌预后转归的分子标志物, 或者成为一个肝癌药物治疗的分子靶点还有待进一步研究.

评论

背景资料

肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤, 死亡率在我国恶性肿瘤中居第2位, 其高转移高复发是导致死亡率居高不下的主要原因, 目前尚缺乏一种高效敏感的HCC转移复发的诊断标志物.

同行评议者

代智, 副研究员, 复旦大学附属中山医院肝癌研究所; 田字彬, 教授, 青岛大学医学院附属医院

研发前沿

最近研究发现在乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、肝癌、白血病等多种肿瘤中原癌蛋白(Op18)的表达参与了肿瘤的发生, 可作为肿瘤辅助诊断、治疗分子标志物和药物靶点.

相关报道

有多个研究小组发现, 在直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌等多种属多类型的肿瘤细胞中Op18的蛋白表达可以促进肿瘤细胞的运动, 改变细胞的形态, 并参与肿瘤的侵袭运动.

创新盘点

该研究进一步研究Op18蛋白表达与肝癌侵袭转移的关系，为探讨HCC侵袭转移的分子机制, 筛选肝癌转移的诊断标志物提供了实验基础.

应用要点

侵袭转移是肝癌恶性程度的具体表现, Op18基因表达沉默可抑制肝癌细胞的粘附、运动和侵袭; 肝癌组织中Op18蛋白表达水平与肝癌的转移呈正相关, 提示Op18的表达可能预示肝癌的侵袭转移.

同行评价

本论文从细胞水平研究显示Op18表达能促进肝癌细胞的侵袭运动, 在肝癌发展中发挥作用, 实验设计比较完善, 有一定创新性.

备注

编辑:曹丽鸥 电编:鲁亚静

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