研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-06-28; 20(18): 1653-1656
在线出版日期: 2012-06-28. doi: 10.11569/wcjd.v20.i18.1653
SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响
刘芳, 刘浩, 宋丽秀, 陈卫刚, 黎永军, 郑勇
刘芳, 刘浩, 宋丽秀, 陈卫刚, 黎永军, 郑勇, 石河子大学医学院第一附属医院消化内科 新疆维吾尔自治区石河子市 832002
刘芳, 在读硕士, 住院医师, 主要从事肝硬化门脉高压方面的研究.
作者贡献分布: 本课题由刘芳、陈卫刚及郑勇设计; 研究过程由刘芳与刘浩完成; 研究所用试剂由陈卫刚与郑勇提供; 数据分析由刘芳、宋丽秀及黎永军完成; 本论文写作由刘芳、郑勇及陈卫刚完成.
通讯作者: 郑勇, 教授, 主任医师, 博士生导师, 832002, 新疆维吾尔自治区石河子市北二路32小区, 石河子大学医学院第一附属医院消化内科. zy2850@126.com
电话: 0993-2859284
收稿日期: 2012-03-13
修回日期: 2012-05-07
接受日期: 2012-06-01
在线出版日期: 2012-06-28

目的: 探讨SB431542对肝星状细胞T6(HSC T6) Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响.

方法: HSC T6细胞贴壁后, 在细胞培养瓶中加入SB431542 10 μmol/L培养2 h, 用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察细胞内Smad4蛋白细胞内转位. 将HSC T6细胞分成3组: 空白对照组、SB431542 1 μmol/L组、SB431542 10 μmol/L组, 培养24 h后分别提取细胞浆蛋白及核蛋白, 以Western blot法检测Smad4蛋白表达水平变化.

结果: SB431542 10 mol/L作用2 h后, 未出现Smad4蛋白向细胞核内转位. HSC T6细胞贴壁后被SB431542 1 μmol/L、SB431542 10 μmol/L作用24 h后, 细胞浆内Smad4蛋白表达量较空白对照组减少, 呈剂量依赖型; 而细胞核内Smad4蛋白表达量较空白对照组增多.

结论: SB431542通过抑制大鼠HSC活化过程中Smad4蛋白在细胞内的核转位, 可起到阻断TGF-β1/Smad通路的细胞内信号转导的作用.

关键词: SB431542; 大鼠肝星状细胞; Smad4蛋白
引文著录: 刘芳, 刘浩, 宋丽秀, 陈卫刚, 黎永军, 郑勇. SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响. 世界华人消化杂志 2012; 20(18): 1653-1656
SB431542 alters the expression and intracellular translocation of Smad4 protein in HSC-T6 cells
Fang Liu, Hao Liu, Li-Xiu Song, Wei-Gang Chen, Yong-Jun Li, Yong Zheng
Fang Liu, Hao Liu, Li-Xiu Song, Wei-Gang Chen, Yong-Jun Li, Yong Zheng, Department of Digestive Diseases, the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Correspondence to: Yong Zheng, Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University, Beier Road, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China. zy2850@126.com
Received: March 13, 2012
Revised: May 7, 2012
Accepted: June 1, 2012
Published online: June 28, 2012

AIM: To investigate the expression and intracellular translocation of Smad4 protein in HSC-T6 cells treated with SB431542.

METHODS: Adherent HSC-T6 cells were incubated with SB431542 (10 μmol/L) for two hours, and the intracellular translocation of Smad4 protein was observed by immunofluorescence using a Laser scanning confocal microscope. Another part of HSC-T6 cells were randomly divided into three groups: a normal control group and two SB431542 treatment groups (treated with 1 and 10 μmol/L of SB431542, respectively). After incubation with SB431542 for 24 hours, cytoplasmic protein and nuclear protein were extracted and detected by Western blot.

RESULTS: Intracellular translocation of Smad4 protein did not occur when the cells were incubated with 10 μmol/L of SB431542 for two hours. Compared to the control group, the expression of Smad4 protein in the cytoplasm increased and that in the nucleus decreased after treatment with SB431542 for 24 h, and the effects were does-dependent.

CONCLUSION: SB431542 blocks the TGFβ1/Smads signaling pathway by inhibiting Smad4 nuclear translocation in HSC-T6 cells.

Key Words: SB431542; Hepatic stellate cells; Smad4
0 引言

肝纤维化的发生是由于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解失衡造成的. ECM主要来源于肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC), HSC激活是肝纤维化形成的关键[1]. 目前已证实转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在HSC激活过程中起着关键调节作用, Smads蛋白为TGF-β家族的特异性细胞内信号转导分子. TGF-β1/Smad信号转导在ECM表达调节中的作用是研究肝纤维化的热点[2]. 已知的一种小分子物质(SB431542)是TGF-β1Ⅰ型受体的特异性阻断剂[3]. 本研究拟通过观察Smad4蛋白在肝星状细胞系HSC T6细胞内的转位及细胞浆、细胞核内蛋白量的变化情况, 初步验证SB431542可能通过阻断Smad4蛋白在细胞内的转位及表达量的变化发挥抑制HSC T6细胞活化的作用.

1 材料和方法
1.1 材料

肝星状细胞HSC T6细胞株购自中南大学湘雅中心实验室; 胎牛血清、DMEM(高糖)培养基、胰蛋白酶-EDTA、PBS缓冲液购自美国Hyclone公司; SB431542(S4317)购自美国Sigma公司; Smad4蛋白(SC-7966)一抗为美国Santa Cruz北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装.

1.2 方法

1.2.1 HSC T6细胞培养: HSC T6选用100 mL/L FBS DMEM(高糖)培养液, 按2×105个/mL接种, 37 ℃、50 mL/L CO2中培养, 8 h常规贴壁, 24 h换液, 2-3 d后细胞铺满瓶底70%-90%传代, 传至细胞生长活跃, 传代周期稳定即可用于实验.

1.2.2 激光共聚焦显微镜观察细胞内Smad4蛋白细胞内转位: 在培养皿中放入20 mm×20 mm盖玻片, HSC T6以2×105个/mL接种, 8 h贴壁后, 分2组处理: 空白对照组、SB431542 10 μmol/L组. 分别继续培养2 h, 以4%多聚甲醛进行细胞固定, 蒸馏水冲洗后, 山羊血清封闭, 滴加一抗Smad4(1:200), 湿盒内4 ℃过夜(>8 h), 滴加荧光二抗(Smad4 FITC 1:50), 湿盒内室温孵育2 h, 含50%甘油的PBS封片, 激光共聚焦显微镜下观察.

1.2.3 Western blot法检测Smad4蛋白表达水平变化: 以2×105/mL的浓度将HSC T6细胞接种到培养甁中, 8 h后细胞贴壁. 分3组: 空白对照组、SB431542 1 μmol/L组、SB431542 10 μmol/L组, 培养24 h后分别提取细胞浆蛋白及核蛋白. 统一蛋白浓度为1 g/L, 蛋白变性后待用. 每孔每次加样20 μL, 在SDS-PAGE凝胶中电泳分离, Mark位置标记, 湿转法将蛋白从凝胶中转至PVDF膜上, 室温下5%脱脂奶粉封闭2 h, 加Smad4(1:200)一抗, 室温下孵育2 h后转至4 ℃冰箱过夜. TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗, 室温下孵育90 min, TBST洗膜后加入化学发光试剂曝光, 显影、定影后将胶片置于凝胶成像分析进行定量分析. 用同样的方法检测β-actin内参蛋白的表达.

统计学处理 结果以mean±SD表示, 不同浓度的SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白表达的影响采用单因素方差分析, 用SPSS17.0统计软件进行分析.

2 结果
2.1 免疫荧光观察细胞内Smad4蛋白细胞内转位

经免疫荧光FITC标记, Smad4蛋白呈绿色, 空白对照组Smad4主要定位于细胞核内, 发生转位; SB431542 10 μmol/L作用组Smad4定位于细胞浆内, 未出现转位, 即TGF-β1/Smads的细胞内信号转导中断(图1). 说明10 μmol/L SB431542可抑制HSC T6活化过程中Smad4由胞浆向胞核的正常转位.

图1
图1 HSC T6细胞中SB431542作用后Smad4蛋白的细胞内定位(×200). A: Smad4空白对照组; B: Smad4 SB431542 10 μmol/L.
2.2 Western blot法检测Smad4蛋白表达水平

与正常对照组比较, SB431542 1 μmol/L组及SB431542 10 μmol/L组均能够增强细胞浆内的Smad4蛋白的表达(P<0.05); 同时随SB431542剂量的增加, 胞浆内Smad4的表达增强(P<0.05). 细胞核内的Smad4蛋白的表达趋势与浆内相反, 与对照组相比, SB431542作用组均可减少Smad 4的表达(P<0.05), 随剂量增大, 胞核内Smad 4的表达量减少(P<0.05, 图2).

图2
图2 不同浓度的SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白表达的影响. A: Western blot; B: Smad4蛋白表达柱状图. 1: 空白对照组; 2: SB431542 1 μmol/L; 3: SB431542 10 μmol/L aP<0.05 vs 1组; cP<0.05 vs 2组.
3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程, 最终可发展成肝硬化, 引起肝功能衰竭, 导致死亡. 因此, 肝纤维化能否逆转、可以逆转的阶段及其逆转机制一直是研究的特点. HSC活化是肝纤维化的核心环节. HSC是肝内胶原及其他ECM的主要来源. 在肝脏受损伤时, 由于炎症和细胞因子的作用, 处于静止状态的HSC被激活, 进而分泌大量的ECM, 并表达α-平滑肌激动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和金属蛋白酶组织抑制剂-1等促纤维化因子, 对肝纤维化的发生和发展起着重要的作用. 这些细胞因子有TGF、结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子、内皮素等. TGF-β1在此过程中起重要作用,是促活HSC并促进其表达ECM的关键因子[4].

目前认为, TGF-β1发挥作用首先要与细胞膜表面的Ⅱ和Ⅰ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体形成异四聚复合体. 在这个复合体中, Ⅱ型受体是组成性的自动磷酸化组分, 他将Ⅰ型受体的GS结构域磷酸化[5]. Smad蛋白是目前所知唯一的Ⅰ型受体胞内底物, 介导TGF-β1的胞内信号转导, 是TGF-β家族信号从受体到核的细胞内转导分子[6]. Smads蛋白目前已知至少有9种蛋白, 分为3类: 受体依赖性Smad蛋白(R-Smad: Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9), 介质性Smad蛋白(Co-Smad: Smad4), 抑制性Smad蛋白(I-Smad: Smad6、Smad7). 有研究证实, Smad2和Smad3通过SARA(smad anchor for receptor activation)结合到活化的Ⅰ型受体, 在其C-末端磷酸化后与Ⅰ型受体解离, 并与Smad4形成异聚复合体转入核内, 调节靶基因的表达. 故Smad4蛋白在信号传输途径中处于中枢地位, Smad4与活化的R-Smad结合形成复合物正常转入细胞核内是TGF-β1介导的HSC活化, 促进ECM沉积的关键环节[7]. 在HSC活化过程中, 抑制Smad4的表达可显著降低细胞培养上清液中Ⅲ型胶原的含量. 李萍等[8]通过实验提出调整Smad4分子的表达水平有望成为临床上防止肝纤维化的一个有效途径.

活化素激酶样受体(activin receptor-like kinase, ALK)是TGF-β1的关键膜受体, TGF-β1与ALK的结合调控着该条生物信号通路的正常传导. SB431542是一种TGF-β1超家族Ⅰ型受体ALK4、ALK5和ALK7的特异性阻断剂[3,9]. 已有研究结果显示, SB431542可通过阻断TGF-β1与Ⅰ型受体的结合, 改善TGF-β1/Smad信号通路介导产生的炎症、纤维化、肿瘤等多种生物学效应. Xiao等[10]认为, SB431543可抑制手术后皮肤瘢痕纤维组织的形成; Waghabi等[11]提出, SB431542作为TGF-βⅠ型受体ALK5的特异性阻断剂, 通过阻断TGF-β通路可抑制南美地区心肌细胞锥虫感染周期性信号通路的传导; Mark论证了SB431542可抑制TGF-β通路介导的人体胶质瘤细胞的增殖作用[12]. Halder等[13]证实了SB431542可通过抑制TGF-β诱导的肿瘤细胞的基因及蛋白表达, 促进了肿瘤细胞的凋亡. Segawa等[14]利用SB431542特异性阻断ALK5的作用, 减弱了TGF-β抑制白介素对肺间质纤维化疾病的作用. Liu等[15]还论证了SB431542通过阻止TGF-βR1介导的Smad3磷酸化、抑制Smad3调控基因的表达, 进一步证明了SB431542对Smad4上游蛋白亦起到了相同作用. 在人HSC活化过程中发现, SB431542可阻止TGF-β1介导的Smad3磷酸化, 抑制Smad3调控基因的表达, 并呈一种剂量依赖的方式阻断TGF-β1诱导的ECM基因表达和Smad3磷酸化[16].

本实验通过加用SB431542作用于大鼠HSC的活化过程, 利用共聚焦显微镜观察Smad4蛋白在细胞内的转位情况, 发现经SB431542作用后的HSC、Smad4未能正常转位进入细胞核, 说明SB431542通过阻断TGF-β1与Ⅰ型受体的结合未能正常形成异四聚复合体, 而异四聚复合体不能继续与胞内底物Smad2、Smad3结合使其磷酸化后再结合Smad4形成异聚复合体跨核膜进入核内调节靶基因的表达. 分别提取SB431542作用后的HSC细胞浆与细胞核蛋白, 测定Smad4蛋白表达量, 结果显示, SB431542作用后的HSC细胞浆内Smad4蛋白较正常活化的浆Smad4蛋白含量表达增高; 同时细胞核内的Smad4蛋白表达情况较浆Smad4趋势相反. 说明SB431542可通过阻断Smad4复合物的正常转位, 抑制TGF-β1/Smads通路的传导, 并且其抑制作用随SB431542浓度的增加而增强. Ⅰ型受体活化是TGF-β1信号转导的起点, 也是最关键的一步, SB431542阻断TGF-β1/Smad的上游信号通路, 引起有活性的TGF-β1未能与Ⅰ型受体胞内特异性激酶Smads蛋白结合, 不能正常形成Smad4蛋白异聚复合体进入细胞核, 从而影响了TGF-β1信号从胞浆向胞核的转位聚集.

SB431542是一种小分子水合物, 可阻断TGF-β1与Ⅰ型受体ALK4、ALK5和ALK7的结合, 在一定程度上减少了TGF-β1的信号传导. SB431542已在多个脏器TGF-β1介导的抗纤维化及肿瘤发生方面显示了其优势作用, 但其应用于临床还有待进一步研究. 本研究结果论证了SB431542在大鼠HSC细胞活化过程中, 可阻断TGF-β1信号通路中具有中枢地位的Smad4复合物的核转位过程, 为SB431542可能成为阻断TGF-β1信号传导的药物, 发挥减轻HSC的活化, 抑制并减缓肝纤维化的作用提供一定的实验依据.

评论
背景资料

活化的肝星状细胞(HSC)在肝纤维化过程中起关键作用, 是肝纤维化的细胞学基础. TGF-β1作为肝纤维化最关键的细胞因子, 以其为靶目标的抗纤维化治疗仍是当今的研究特点.

同行评议者

吴君, 主任医师, 贵阳医学院附属医院感染科

研发前沿

TGF-β1与单次跨膜蛋白激酶受体I和II的结合并活化, 是TGF-β1/Smad信号通路的开端. 研究开发能抑制TRBI和TRBII活化的药物是阻断TGF-β1/Smad通路的研究特点之一.

相关报道

赵彩彦等人报道应用SB431542阻止人肝星状细胞活化过程中TGF-β1介导的Smad3磷酸化, 可抑制Smad3调控基因的表达, 并呈一种剂量依赖的方式阻断TGF-β1诱导的ECM基因表达和Smad3磷酸化.

创新盘点

本研究从胞内信号转导层面, 运用分子生物学技术论证TRBI受体阻断剂对TGF-β1/Smad通路转导中枢物质Smad4核转位的影响, 进一步证实了此类受体阻断剂改善TGF-β1/Smad信号通路介导产生的炎症、纤维化、肿瘤等多种生物学效应的作用.

同行评价

本研究旨在阐明TGF-β1受体阻断剂可改善TGF-β1/Smad信号通路介导产生的炎症、纤维化、肿瘤等多种生物学效应, 实验数据客观, 有一定的学术价值.

编辑:张姗姗 电编:闫晋利

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