Wnt信号转导通路与肝纤维化关系的研究现况

摘要

Wnt信号转导通路是近年来分子生物学、细胞生物学和肿瘤研究中的一大热点, 其参与调控细胞分化、癌变、凋亡及机体免疫、应激等多种病理生理过程. 目前许多关于癌症方面的研究均已证实, 阻断Wnt信号通路可以诱导癌症细胞的凋亡. 肝纤维化的发生与多种信号通路的激活相关, 有研究证实Wnt信号通路也参与了肝纤维化的发生, 阻断该通路可以抑制HSC增殖及诱导其凋亡. HSC的活化作为肝纤维化发生的关键环节, 通过诱导其凋亡有可能成为一种新的肝纤维化治疗方法. 研究Wnt信号通路与肝纤维化关系为将来临床应用提供一定的理论基础.

关键词: Wnt信号转导通路; 肝星状细胞; 肝纤维化

Relationship between the Wnt signaling pathway and liver fibrosis: recent research status

Zan-Yan Wan, Guo-Xin Hu

Zan-Yan Wan, Guo-Xin Hu, Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30760230.

Correspondence to: Associate Professor Guo-Xin Hu, Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, 17 Yongwai Zheng Avenue, Donghu District, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. huguoxin8228@sina.com

Received: April 14, 2011
Revised: May 14, 2011
Accepted: May 17, 2011
Published online: June 18, 2011

Abstract

The Wnt signaling pathway participates in many physiological and pathological processes such as cell differentiation, carcinogenesis, apoptosis, immunity, and stress. Many studies have shown that blockage of the Wnt signaling pathway can induce cancer cell apoptosis. Many signaling pathways are associated with the pathogenesis of liver fibrosis. Several studies have shown that the Wnt signaling pathway is involved in the formation of liver fibrosis. Blockage of the Wnt signaling pathway could inhibit the proliferation and induce the apoptosis of hepatic stellate cell (HSC). Since the activation of HSC plays a key role in the pathogenesis of liver fibrosis, induction of HSC apoptosis represents a new strategy for treating the disease. Elucidation of the relationship between the Wnt signaling pathway and liver fibrosis will certainly provide a theoretical basis for clinical treatment of the disease.

Key Words: Wnt signaling pathway; Hepatic stellate cell; Liver fibrosis

0 引言

肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应, 导致肝小叶内和汇管区大量纤维组织增生和沉淀, 病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)各种成分合成增多, 降解相对不足, 但并未形成小叶内间隔(再生结节), 如进一步发展则进入肝硬化不可逆转阶段. 肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)被认为是肝脏合成ECM的主要细胞, 其激活发生肌成纤维细胞的表型转换被认为是肝纤维化发生的中心环节[1,2]. Wnt信号通路途径最初的研究主要集中在胚胎发育和干细胞维持分化方面, 目前认为该信号通路参与了肿瘤的发生, 阻断该通路可以抑制癌细胞的增殖和诱导凋亡[3]. 近年来研究认为该信号通路与多种器官纤维化的发生有关, Liu等[4]用博来霉素诱导的肺纤维化家鼠模型中发现肺纤维化区域上皮细胞表达β-catenin增多, 其下游基因产物cyclin D1、MMP-7和TGF-β在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞以及间质中的表达也相应有所上升; Hwang等[5]认为Wnt/β-catenin信号参与了肾纤维化的发生.

最近较多研究[6-8]也证实了Wnt信号通路参与了HSC的活化及肝纤维化的发生, 本文就Wnt信号通路与HSC、肝纤维化的关系作一简要综述, 为将来抗纤维化治疗提供一定理论依据.

1 Wnt信号转导通路

现认为Wnt信号大体分为两种通路, 即经典β-catenin依赖信号通路和非经典β-catenin独立通路.

经典β-catenin依赖信号通路即Wnt/β-catenin通路, 主要成员包括Wnt蛋白家族、Frizzled/低密度脂蛋白受体相关蛋白(Fz/LRP)、Dishevelled蛋白(Dsh)、β-catenin、β-catenin降解复合体以及T淋巴细胞因子/淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, Tcf/Lef)转录因子家族等[9]. β-catenin降解复合体由糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、酪蛋白激酶Iα(casein kinase Iα, CKIα)、支架蛋白(Axin)、结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)基因蛋白组成, 其中Axin与APC起着载体的作用. 当经典Wnt信号通路被激活时, 分泌到细胞外的Wnt蛋白与跨膜受体Fz和低密度脂蛋白相关受体LRP5/6复合物结合, 并激活细胞内的Dsh, 激活的Dsh可抑制GSK-3β的活性并使其从Axin上脱落, 从而影响了酶体复合物中CKIα及GSK-3β对β-catenin丝氨酸及苏氨酸的磷酸化及降解, 导致β-catenin在胞质中的累积. 当β-catenin积累达到一定游离水平时即可发生核转移, 并与核内转录因子Tcf/Lef结合形成转录复合物, 激活相关目的基因的表达, 引起细胞生物活性的改变[9]. 另外还有Siah介导的β-catenin非依赖经典磷酸化的降解途径, 以及非Wnt信号通路蛋白与β-catenin之间相互作用构成不同信号间的对话[10]. Soriano等[11]对老年性痴呆病研究中发现GSK-3、β-catenin、蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)可与早衰蛋白1结合形成复合物, 早衰蛋白1与PKA之间的相互作用可增强依赖性GSK-3对β-catenin的磷酸化作用过程, 导致β-catenin的降解, 该研究证实了PKA与早衰蛋白1结合可抑制Wnt信号分子β-catenin的转导. 然而与之相反的结论关于人胚肾细胞培养的研究却表明了PKA增加了HEK-293细胞Tcf的转录, 前列腺素E2激活PKA后可直接磷酸化β-catenin Ser675, 抑制其泛素化, 引起其在细胞内的累积, 发生核内转移[12]. 上述两者关于PKA与Wnt通路之间关系的研究结论存在分歧, 至今为止还没有确切的说法, 值得进一步探讨.

非经典β-catenin独立通路有多种, 其中研究最多的包括Wnt/Ca²⁺通路和细胞急性通路(planar cell polarity pathway, PCP)[13,14]. 在Wnt/Ca²⁺信号通路中, Wnt-Fz受体结合复合物通过G蛋白激活磷脂酶C, 从而导致细胞内Ca²⁺水平升高及下游信号分子蛋白激酶C的激活. PCP通路通过激活Dvl、小G蛋白(Rho或者Rac)以及 Rho激酶JNK来发挥调节细胞骨架、细胞移行以及细胞极性的作用[15]. PCP及Wnt/Ca²⁺通路均证实在癌症方面起着不可或缺的作用[14], 如非经典蛋白Wnt5a可通过激活PKC/Ca²⁺诱导上皮向间叶细胞转换(epithelial mesenchymal transition, EMT), 介导黑素瘤的转移[16]. 尽管在果蝇中没有发现Wnt蛋白参与到PCP通路中[17], 但是在脊椎动物中PCP通路可由非经典Wnt蛋白如Wnt5a和Wnt11激活, 这些蛋白并不介导β-catenin的激活[18,19].

2 Wnt蛋白及其受体

Wnt蛋白是一种富含半胱氨酸高度保守的分泌性糖蛋白, 至今研究发现主要有19个Wnt蛋白[20], 参与经典信号通路的Wnt蛋白有Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8等, 参与非经典信号通路Wnt蛋白有Wnt5a、Wnt4、Wnt11等. Wnt基因家族在肝脏各种细胞中均有表达, 某些经典及非经典Wnt蛋白在成年小鼠肝脏的各种细胞中均有表达, 包括肝细胞、胆管上皮细胞、HSC和Kupffer细胞, 例如Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt11在肝细胞中表达, Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16在HSC中表达[21]. 同时, 各种细胞在激活或静止状态下Wnt蛋白表达也是不一样的, 各自介导不同信号转导引起病理生理的变化, 导致不同种疾病的发生.

Wnt信号受体包括主要受体和共同受体. Fz作为Wnt信号的主要受体是一种7次跨膜蛋白, 至今发现有10种即Fz-1至Fz-10, 不同的Wnt蛋白可以与相同或不同的Fz受体结合, 然后激活不同或相同的下游分子介导Wnt/β-catenin、PCP及Wnt/Ca²⁺ 3种信号通路的传导. LRP5/6是Wnt信号通路共同受体, 他与Fz受体并不是单独各自与Wnt蛋白配体结合发挥信号转导作用的, 而是两者共同与Wnt蛋白构成三聚体, 从而发生配体与受体的结合. Wnt蛋白在此复合物中发挥着中介调节作用, 受体Fz和LRP5/6细胞外区域分别与Wnt蛋白不同部位结合后导致各自细胞内结构的变化, 激活信号转导. 另外, Fz受体种类可识别不同种Wnt蛋白, 与之结合可激活3种不同信号通路的传导, 如表达有Fz-1的大鼠可促进Wnt8在细胞表面的聚集从而导致Wnt/β-catenin通路的激活, 相反, 发现表达有Wnt5a或者Fz-2受体的非洲爪蟾蜍细胞内的Ca²⁺水平增高, 进一步促进PKC的激活[22].

3 Wnt信号转导通路的目的基因及抑制剂

Wnt经典信号通路通过核内β-catenin激活的Tcf/Lef刺激各种目的基因的表达, 包括c-Myc、cyclin D1、Fra1、c-Jun、过氧化物酶增殖激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)、交配相关蛋白、CD44、尿激酶型纤溶酶原激活受体、Tcf/Lef基因结合位点的激活因子基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)(MMP2、MMP3、MMP7和MMP9)、COX-2以及VEGFR等[23-25]. MMPs是一类具有Ca²⁺-Zn²⁺离子依赖的内源性蛋白酶, 肝内主要由HSC合成, 可降解多种ECM成分, 在肝纤维化的发展过程中起着重要的作用.

Wnt信号通路抑制剂主要包括有分泌Fz相关蛋白(secreted Frizzled related proteins, sFRPs)和Wnt抑制蛋白(Wnt inhibitory protein, WIF). sFRPs和WIF可分别与Wnt蛋白结合, 同时sFRPs也可与Fz受体结合, 从而导致经典信号及非经典信号两条通路传导的抑制. 另外某些sFRPs可与非Wnt信号成员分子相互作用参与细胞的代谢, 例如肿瘤细胞分泌的sFRP2在ECM累积通过与纤连蛋白-整合素复合物相互作用, 磷酸化FAK及激活NF-κB从而抑制细胞的凋亡及JNKs, 进一步提高乳腺肿瘤细胞生存性[26].

Wnt信号抑制剂还包括有Dkk蛋白家族, 例如DKK-1作为LRP5/6拮抗配体可特定抑制Wnt/β-catenin信号通路的传导. Wise和SOST组成另外一类LRP5/6拮抗配体家族, 体外实验发现其作用机制与Dkk-1相似, SOST可降解Wnt蛋白-Fz-LRP6三聚体复合物, 从而发挥对该信号通路的抑制作用[27]. 另外, Shisa蛋白家族是研究较少的Wnt信号抑制剂.

4 Wnt信号通路参与HSC活化与增殖

HSC是一种肝脏非实质性细胞, 其激活在肝纤维化形成的过程中发挥着至关重要的作用. 最近有研究表明HSC作为一种前体细胞, 可分化为内皮细胞、肝细胞血统样(lineages), 并进一步在大鼠实验中发现其表达有干细胞标志物CD133及Oct4[28,29]. 静止的HSC富含维生素A及表达神经纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 激活分化为肌成纤维细胞过程中表达α-SMA及合成谷氨酰胺合成酶. Wnt信号被证实在肝脏胚胎分化发育中有着重要的作用, 引起肝脏体积的增大及肝细胞数量的增多等, 同时被证实与HSC的增殖与分化也存在着密切联系.

Kordes等[28]研究发现在静止的HSC中, β-catenin及经典Wnt蛋白Wnt1、Wnt2、Wnt3/3a、Wnt7a/b、Wnt8a、Wnt10b等均有表达; 在HSC分化为肌成纤维细胞的过程中, 经典蛋白虽也有所表达, 但相对于静止状态而言, 其表达水平有所下降, 同时非经典Wnt蛋白Wnt4、Wnt5a和Wnt11等的表达反而上升. 另外, 通过GSK-3β抑制剂TWS119模仿经典Wnt信号通路刺激HSC后, 发现α-SMA、增殖细胞核抗原Ki-67(99±1)%、Wnt5a等表达均下降, 而GFAP、Wnt10b表达上升, 这说明了经典Wnt信号通路参与了HSC静止状态的维持, 降低了DNA的合成及阻止了HSC进入细胞周期循环. 虽然上述研究表明了经典Wnt信号通路并不参与HSC向成纤维细胞(myofibroblast, MFB)的转化, 但近几年越来越多研究结果显示经典Wnt信号通路参与了HSC活化、增殖等的过程. 2006年Haughton等[30]短期使用利福平可以抑制体外培养的从人肝脏提取出的HSC α-SMA、TGF-β1的表达, 同时下调Wnt信号相关基因β-catenin和桥粒胶蛋白(desmocollin)的表达, 这在一定程度说明了经典Wnt信号参与了HSC的活化增殖, 并可能与TGF-β1信号之间存在着一定的交叉. 翁志宏等[31]通过转染Tcf依赖的荧光素酶报告质粒(pTOPFLASH)检测HSC-T6细胞内的Wnt/β-catenin转录活性, 发现HSC-T6转染阳性组荧光素酶活性明显高于阴性对照组(P<0.01), 表明活化的HSC过程中有经典Wnt的激活, 并将Tcf的显性负性突变体dnTcf表达质粒转染HSC-T6抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活, α-SMA和I型胶原蛋白表达下降(P<0.05), 进一步说明了经典Wnt信号通路与HSC活化密切相关. Kang等[6]关于姜黄素的研究认为氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)通过结合受体(LDL-1)可诱导HSC的激活, 表达TGF-β1、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、α-SMA及Ⅰ型胶原等, 而姜黄素则可抑制Wnt3a介导的经典Wnt信号激活诱导的LDL-1的表达, 同时β-catenin降解增多. 李文庭等[7]利用载有WIF-1的真核质粒转染HSC-T6后发现其活性较转染对照组和阴性对照组明显下降(均P<0.05), 同时α-SMA、Smad3及β-catenin的表达下降, 这说明通过阻断Wnt经典信号可抑制HSC的活化. 最近Li等[8]另外一项关于这方面的研究进一步证实了上述观点, 同样用质粒转染技术发现Wnt信号抑制剂Pokeweed抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein, PAP)可减轻肝纤维化的病理改变, 改善肝功能, 降低模型大鼠的α-SMA、β-catenin的表达及体外培养HSC的活力.

目前大量研究证实非经典Wnt信号也参与了HSC的活化与增殖. Jiang等[32]研究使用微阵列法检测了几千个基因, 发现受体Fz-2及配体Wnt4、Wnt5等基因在激活培养的HSC和肝纤维化组织中表达均上升, 而磷酸化的β-catenin和核转入并无明显改变, 由此可说明非经典Wnt信号Wnt5a、Fz-2参与了HSC向肌成纤维母细胞的分化和肝纤维化的形成. 用血小板衍生生长因子-BB(platelet derived growth factor, PDGF-BB)激活HSC, 在48 h后用DNA微阵法在基因水平上检测显示Fz-10和α-钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ alpha, CAMK2A)表达上升, 而在蛋白水平上只有Fz-10增高, 由此可知Wnt/Ca²⁺通路参与了HSC的激活与增殖[33]. 非经典信号蛋白Wnt4、Wnt5a及受体Fz-1、Fz-2、LRP6和Ryk mRNA水平在培养激活7 d的HSC中表达明显上升, 相比静止的HSC上升3-12倍左右, 并通过诱导cyclin D1和抗脂肪生成因子(PPARβ)来刺激HSC的增殖, α-SMA蛋白表达也随着增加[34]. 另外, 非经典蛋白Wnt4及其受体Fz-2在SD大鼠肝纤维化模型肝组织中的表达较正常大鼠相对增多, 这表明了非经典Wnt信号通路可能介导了肝纤维化动物模型的发生机制[35].

5 Wnt信号通路参与HSC的凋亡信号

近年来许多关于肿瘤及癌前病变的研究都证实了阻断经典Wnt信号通路可诱导相关病变细胞的凋亡. 在癌前病变的肝组织中发现Wnt/β-catenin信号是激活的, 干扰素-α2b可抑制该信号通路并促进细胞的凋亡[36]. 还有研究发现非典经蛋白Wnt5a可促进间质性肺炎中肺成纤维细胞的增殖及抑制H²O²诱导的凋亡, 增加粘连蛋白及整合素-α5的表达[37].

最近关于促HSC凋亡在肝纤维化治疗机制研究方面, Wnt信号作为HSC凋亡信号的一条途径逐渐被引起重视, 关于这方面相关研究有可能为将来治疗肝纤维化奠定实验基础. Wnt信号抑制参与了姜黄素诱导的人端粒逆转酶引起的HSC凋亡, 其相关信号成员Axin及FOS样抗原1(FOS-like antigen 1, FRA1)的蛋白表达有所下降[38]. Cheng等[34]分别从体外培养的HSC和从胆汁阻塞性肝纤维化大鼠模型中分离提取的HSC中证实Wnt信号共同受体阻断剂DKK-1可增加脂肪形成转录因子(C/EBPα)及PPARγ的表达, 从而使得HSC维持静止状态, 同时运用TUNNEL荧光染色发现DKK-1的高表达可增加HSC的凋亡, caspase3蛋白表达相应增加. Myung等[39]研究表明经典Wnt3蛋白可激活人HSC LX-2并抑制肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)诱导的凋亡, LX-2细胞Fz2、Fz7、Fz10和Ⅰ型胶原的基因表达增加, α-SMA蛋白表达也上升; 而sFRP1的过表达则可以拮抗Wnt3a对其的激活作用, caspase3表达水平明显提高, 增强了TRAIL诱导的HSC凋亡.

6 Wnt信号与肝纤维化机制信号间的对话

肝纤维化形成过程中受到众多细胞因子的调节, 目前认为其中最重要的是PDGF与TGF-β. TGF-β1是HSC活化、增殖必需的调节因子, TGF-β1先与跨膜蛋白Ⅱ型受体结合, 再与Ⅰ型受体结合激活形成Ⅱ型受体-TGF-β1-Ⅰ型受体三聚体复合物, 活化的受体催化一类重要的信号分子Smad发生丝氨酸磷酸化, Smad分子形成同源或异源寡聚体后进入细胞核, 调节相关基因的转录. 有研究表明β-catenin可通过结合Smad核转入复合物调控依赖Smad信号的基因转录[40,41]. 李文庭等[7]实验发现了Wnt信号抑制剂WIF-1可下调活化HSC的β-catenin表达, 同时还可抑制Smad3的表达, 两者表达具有相关性, 这说明WIF可通过阻断TGF-β1信号通路从抑制活化HSC, 因此认为TGF-β1/Smad与经典Wnt两种信号之间存在着对话(crosstalk). PPARs是一类新的固醇类激素受体, 可被脂肪酸及代谢产物激活, PPARγ的表达增加可以抑制HSC的增殖、迁移, 抑制HSC分泌胶原、促炎因子和多种细胞因子, 此信号分子参与了肝纤维化的抑制. 植物性姜黄素[6]可通过激活PPARγ阻断Wnt信号通路介导的LOX-1基因表达, 从而减少氧化低密度脂蛋白对HSC的诱导激活, 进一步抑制Ⅱ型糖尿病及非酒精性肝炎相关性肝纤维化的发生. 该研究说明了Wnt信号通路与肝纤维化PPARγ信号之间存在着关联和对话.

7 Wnt信号转导通路与肝纤维化的临床研究

目前关于Wnt信号通路与肿瘤疾病的临床研究较多, 如Ding等[42]的研究发现Wnt信号抑制剂DDK-3和WIF-1的下调表达可通过激活Wnt信号通路促进肝癌的发展. 而目前有关Wnt信号通路与肝纤维化的临床研究较少. Shackel等[43]对原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)的临床研究发现, 相比较正常人肝组织, Wnt13、Wnt5a、β-catenin、Fz在PBC肝组织的mRNA表达分别增加了5.7倍、3.6倍、1.8倍、4.4倍, Wnt信号目的基因c-myc、c-jun、c-fos相关抗原1及cyclin D1等的表达也相应增加. 另外相比正常肝组织, Wnt5a、Fz及β-catenin在PBC、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)和HCV相关性肝硬化中的表达均有所上升, 这说明Wnt信号激活参与了所有形式的肝硬化. Bengochea等[44]临床研究表明相比正常人肝组织平均95%人肝细胞癌组织和68%癌周围组织可发生8个Wnt/Fz事件, 他们分别是Fz-3/6/7、Wnt3/4/5a蛋白表达上升及sFRP1/5蛋白表达下降, 并发现非硬化的癌周组织每个样本事件发生数量值为0.6±0.6, 相比硬化的癌周组织1.4±0.9, 差异具有统计学意义(P<0.01), 从而进一步证实了肝硬化的发生与Wnt信号有关.

8 结论

Wnt信号转导通路在肝纤维化发生发展中起着重要作用, 但该通路在肝纤维化发生过程中的具体作用及机制尚未完全阐明. 虽然目前较多研究均证实了Wnt信号通路参与了HSC的活化, 阻断经典或非经典Wnt信号通路可抑制HSC的增殖及诱导其凋亡, 但关于其改善肝功能的研究仍很少, 同时阻断该通路可能具有广泛的不良生物学效应. 关于Wnt信号是否参与HSC的起始激活或是肝纤维化的维持及其调控机制、并与其他信号通路间的相互作用等诸多问题尚有待进一步研究. 随着研究的深入必将有助于揭示Wnt抗肝纤维化的具体机制, 为肝纤维化的防治提供一种新的可能途径及干预靶点.

评论

背景资料

Wnt信号通路途径最初的研究主要集中在胚胎发育和干细胞维持分化方面, 目前认为该信号通路参与了肿瘤的发生, 阻断该通路可以抑制癌细胞的增殖和诱导凋亡.

同行评议者

刘绍能, 主任医师, 中国中医科学院广安门医院消化科

研发前沿

Wnt信号转导通路是近年来分子生物学、细胞生物学和肿瘤研究中的一大热点, 其参与调控细胞分化、癌变、凋亡及机体免疫、应激等多种病理生理过程.

相关报道

Liu等用博来霉素诱导的肺纤维化家鼠模型中发现肺纤维化区域上皮细胞表达β-catenin增多, 其下游基因产物cyclin D1、MMP-7和TGF-β在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞以及间质中的表达也相应有所上升.

同行评价

本文内容丰富, 条理清晰, 可读性强, 反映了研究工作的科学问题和特定内容.

备注

编辑:李薇 电编:何基才

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