k-ras基因突变的定量检测在胰腺疾病诊断中的应用

摘要

目的: 探讨k-ras基因第12密码子突变的定量检测在胰腺疾病鉴别诊断中的价值及其意义. 

方法: 应用肽核酸钳制实时荧光定量PCR方法检测143例胰腺癌、110例慢性胰腺炎以及28名正常人的血液中k-ras基因第12密码子的突变量, 并分析其与相关临床指标的关系. 

结果: 胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人血液中k-ras基因的突变阳性率分别为51.75%、37.27%和7.14%. k-ras基因的突变比例分别为0.821%±0.287%、0.200%±0.064%和0.080%±0.056%. 慢性胰腺炎和正常人即使存在k-ras突变, 其突变比例通常也较胰腺癌低. 胰腺癌患者血液的k-ras突变情况与性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤TNM分期与临床分期无明显相关.

结论:  肽核酸钳制实时荧光定量PCR方法可用于胰腺疾病的鉴别诊断.

关键词: 胰腺疾病; k-ras基因; 突变; 定量检测

Quantitative detection of k-ras codon 12 mutation in pancreatic diseases

Jun-Jun Gu, Jun Gao, Hua Lu, Zhao-Shen Li

Jun-Jun Gu, Jun Gao, Hua Lu, Zhao-Shen Li, Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200433, China

Correspondence to: Professor Zhao-Shen Li, Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University of Chinese PLA, 168 Changhai Road, Shanghai 200433, China. zhslchxh@163.com

Received: October 13, 2010
Revised: November 18, 2010
Accepted: November 23, 2010
Published online: January 8, 2011

Abstract

AIM: To evaluate the value of quantitative detection of a k-ras gene mutation at codon 12 in the diagnosis of pancreatic diseases.

METHODS: k-ras codon 12 mutation was quantitatively detected by peptide nucleic acid-mediated real-time PCR clamping in blood samples from 143 patients with pancreatic cancer, 110 patients with chronic pancreatitis, and 28 disease-free people. The results were analyzed using SPSS 18.0.

RESULTS: The positive rates of k-ras codon 12 mutation in patients with pancreatic cancer, those with chronic pancreatitis and normal disease-free people were 51.75%, 37.27% and 7.14%, respectively. The percentages of k-ras gene mutation in the above three groups of patients were 0.821% ± 0.287%, 0.200% ± 0.064% and 0.080% ± 0.056%, respectively. k-ras codon 12 mutation had no significant correlation with gender, age, smoking, alcohol, TNM stage, and clinical stage in patients with pancreatic cancer.

CONCLUSION: Quantitative detection of k-ras codon 12 mutation can be used to distinguish different pancreatic diseases.

Key Words: Pancreatic disease; k-ras gene; Mutation; Quantitative detection

0 引言

k-ras作为一种癌基因是目前人类研究最为关注的肿瘤相关基因之一. k-ras基因突变常见于胰腺癌、结直肠和肺癌等疾病, 其通常发生于第12、13和61密码子. 在胰腺癌中k-ras基因的突变>90%[1-3], 并且集中于第12密码子, 突变类型中GAT、GTT和CGT 3种突变类型更是占所有第12密码子突变的99%以上. 而k-ras基因的突变通常被认为是胰腺癌发生的早期事件[4], 并且k-ras基因的突变率从正常胰腺导管细胞、慢性胰腺炎的扁平或者乳头状异性增生到胰腺癌, 其突变率逐步升高[5,6]. 因此, 单纯的k-ras基因突变定性检测对于胰腺疾病的诊断并不是十分准确, 而k-ras基因突变的定量检测的结果可能揭示即使同时存在k-ras基因突变, 其突变比例的高低不同, 可能更加有用于对胰腺疾病的鉴别诊断.

1 材料和方法

1.1 材料

收集中国人民解放军第二军医大学附属长海医院消化内科2008-07/2010-08有完整病例资料的胰腺癌患者143例、慢性胰腺炎110例以及正常志愿者28例的外周血. 所有病例均经病史、临床表现、实验室及影像学检查确诊.

1.2 方法

1.2.1 血液样本DNA的抽提: 抗凝全血1 mL加入500-700 μL TT缓冲液, 剧烈振荡后, 低温离心机12 000 r/min, 离心5 min; 收集沉淀加入200 μL PCR裂解液A; 37 ℃水浴过夜. 抽取PCR裂解物(约200 μL), 加入200 μL酚氯仿, 充分混匀后, 12 000 r/min, 离心20 min; 取上清, 加入200 μL氯仿充分混匀, 12 000 r/min, 离心10 min; 取上清, 加入100 μL乙酸铵及2倍体积无水乙醇(约700 μL)充分混匀, 静置1 min后, 12 000 r/min, 离心10 min. 弃上清加入1 mL 70%乙醇洗涤, 12 000 r/min, 离心5 min; 弃上清, 自然风干, 用100 μL TE液溶解沉淀, 应用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度. 分装于-80 ℃保存.

1.2.2 k-ras基因第12密码子突变的检测: 肽核酸钳制实时荧光定量PCR法检测突变. PNA是针对野生型k-ras基因第12、13密码子设计的PNA, 由韩国Panagene公司合成, 其组成为: NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-COOH. k-ras-FAM TagMan MGB探针由美国Applied Biosystems公司合成, 其组成分别为野生型k-ras探针GGT: FAM-CTACGCCACCAGCTCCAACT-MGB; 突变型k-ras探针GAT: FAM-CTACGCCATCAGCTCCAACT-MGB; GTT: FAM-CTACGCCAACAGCTCCAACT-MGB; CGT: FAM-CTACGCCACGAGCTCCAACT-MGB. PCR引物由美国Applied Biosystems公司合成. 上游引物F: 5'-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3'; 下游引物R: 5'-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3'. TaqMan Gene Expression Master Mix购买于美国Applied Biosystems公司. k-ras基因野生型标准品GGT和k-ras基因突变型标准品GAT、GCT、GTT、AGT、CGT、TGT由上海Invitrogen公司合成, 将模板倍比稀释为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、0拷贝, 作为标准品模板. 仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪. 反应体系包括: TaqMan Gene Expression Master Mix 12.5 μL, 上下游引物各0.5 μL(5 μmol/L), PNA 1 μL(10 μmol/L), MGB探针各0.3 μL(10 μmol/L), DNA标准品模板为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、0拷贝, 用无菌双蒸水定容至25 μL. PCR反应条件: 95 ℃预变性10 min, 之后95 ℃变性15 s, 76 ℃ PNA结合15 s, 60 ℃退火60 s, 共50个循环.

1.2.3 k-ras基因第12密码子突变定量的分析: 采用标准品绝对定量PCR的方法得到每个样本的k-ras野生型和k-ras突变型的量. k-ras基因突变比例定义为k-ras突变型/(k-ras野生型+k-ras突变型). 通过数据转化可以得到每个样本所对应的k-ras基因突变比例, 以用于统计学分析.

统计学处理 采用SPSS18.0医学统计软件进行统计分析. 计量资料用mean±SD表示. 各组目的基因的突变量的比较采用Mann-Whitney U检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 k-ras基因在胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人血液中的突变情况

胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人血液中k-ras基因的突变阳性率分别为51.75%、37.27%和7.14%. k-ras基因的突变比例分别为0.821%±0.287%、0.200%±0.064%和0.080%±0.056%(表1). 胰腺癌的k-ras基因的突变比例明显高于慢性胰腺炎和正常人, 其各组之间均有显著差异(P<0.05, 图1). 慢性胰腺炎和正常人即使存在k-ras突变, 其突变比例也较胰腺癌低.

表1 胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群的k-ras基因突变阳性率和突变比例.

疾病分类	n	k-ras基因突变阳性率n(%)	k-ras基因突变比例(%)
胰腺癌	143	74(51.75)	0.821±0.287
慢性胰腺炎	110	41(37.27)	0.200±0.064
正常人群	28	2(7.14)	0.080±0.056

图1 胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人血液中k-ras突变比例.

2.2 k-ras基因突变比例与胰腺癌患者临床病理指标的关系

胰腺癌患者血液的k-ras突变比例与性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤TNM分期与临床分期无明显相关(表2).

表2 k-ras基因突变比例与临床病理参数间的相关性.

临床病例参数	突变比例(%)	P值
性别		0.480
男性	1.000±0.411
女性	0.430±0.205
年龄(岁)		0.828
≥60	0.696±0.369
＜60	0.850±0.564
吸烟		0.908
是	1.696±0.991
否	0.334±0.095
饮酒		0.614
是	3.186±2.759
否	0.504±0.203
肿瘤大小(cm)		0.484
≥2	0.117 ±0.050
<2	0.837±0.035
淋巴血管侵犯		0.313
是	1.102±0.656
否	0.444±0.137
临床分期		0.248
Ⅰ+Ⅱ期	0.278±0.117
Ⅲ+Ⅳ期	0.901±0.409

3 讨论

近年来, 许多研究表明恶性肿瘤细胞内的DNA会出现在血清或者血浆之中. Leon[7]及Shapiro等[8]检测了正常人及消化系良、恶性疾病患者的血浆游离DNA水平, 正常人血浆DNA含量平均是13 μg/L, 良、恶性疾病患者分别是118 μg/L和412 μg/L, 胰腺癌患者可高达650 μg/L. 血浆中突变的基因多与原发灶的突变类型一致, 猜测可能是血循环中破碎的肿瘤细胞释放的DNA[9]. 因此, 通过检测外周血DNA的基因型或者突变来诊断肿瘤是一个值得探讨的领域.

在本研究中, 我们联合应用了肽核酸钳制技术和实时定量荧光PCR技术来定量检测胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人的k-ras第12密码子突变量及其突变比例. 在进行肽核酸钳制实时定量PCR时, 选用了针对k-ras基因第12密码子的TaqMan探针作为荧光显示物. 他具有高特异性的特点, 每一种探针只能检测第12密码子的一种类型突变. 我们在实验中设计了针对于GAT、GTT以及CGT 3种最为常见的突变类型. 既往研究证实[10], k-ras基因第12密码子突变类型多, 同一肿瘤标本或者不同的肿瘤标本中也可能同时存在多种的k-ras第12密码子的突变, 不可避免的减少了检测的敏感性.

Tada等[11]用采用k-ras基因定量检测胰腺疾病EUS-FNA标本提示胰腺癌的k-ras基因突变高于慢性胰腺炎, 而其在良性胰腺病变中, k-ras基因即使存在突变, 其突变比例也较低. 并且, 通过联合k-ras基因突变和细胞学检查有助于提高胰腺癌的准确诊断率.

Shi等[12]在研究胰腺癌和慢性胰腺炎胰液中的k-ras基因的定量检测中, 发现k-ras的突变比例在胰腺癌组中明显高于慢性胰腺炎组, 并且所有胰腺癌组中胰液的k-ras突变类型与原发肿瘤相一致. 在胰腺组中k-ras突变比例比慢性胰腺炎组中k-ras突变比例要高出很多(0.05%-82.00% vs 0.00%-0.70%). 因此, k-ras基因突变的定量检测, 尤其是对于通过血液、胰液、粪便等非创伤检测有望成为胰腺癌筛查的有效手段.

当然, 在临床上以单一的分子生物学指标来确诊胰腺癌是不够的. 除了k-ras基因, p53、p16、DPC4等基因也常用于胰腺癌的诊断[13,14]. 近年来, 基因甲基化和microRNA的众多研究为胰腺癌的联合诊断提供了有利条件. 虽然本实验研究结果提示k-ras基因在胰腺癌和慢性胰腺炎患者的血液中的突变比例不同, 其结果可能有助于通过不同的突变量来区分胰腺疾病, 并且可能对于胰腺癌的预后有提示. 但是由于本实验的样本量较少, 胰腺癌患者的临床资料缺乏有效的生存时间. 因此, 我们需要更多的样本和临床资料来完善这一结果.

评论

背景资料

单纯的k-ras基因突变定性检测对于胰腺疾病的诊断并不是十分准确, 而k-ras基因突变的定量检测的结果可能揭示即使同时存在k-ras基因突变, 其突变比例的高低不同, 可能更加有用于对胰腺疾病的鉴别诊断.

同行评议者

韩天权, 教授, 上海交通大学医学院附属瑞金医院外科、上海消化外科研究所

相关报道

Shi等在研究胰腺癌和慢性胰腺炎胰液中的k-ras基因的定量检测中, 发现k-ras的突变比例在胰腺癌组中明显高于慢性胰腺炎组, 并且所有胰腺癌组中胰液的k-ras突变类型与原发肿瘤相一致.

创新盘点

本研究揭示了即使以往的定性检测实验提示k-ras基因突变的存在, 其突变比例的也存在高低不同, 可能更加适用于对胰腺疾病的鉴别诊断、治疗和预后.

应用要点

本实验研究结果提示k-ras基因在胰腺癌和慢性胰腺炎患者的血液中的突变比例不同, 其结果可能有助于通过不同的突变量来区分胰腺疾病, 并且可能对于胰腺癌的预后有提示.

名词解释

k-ras基因突变比例: 为k-ras突变型/(k-ras野生型+k-ras突变型). 肽核酸(PNA)是一种DNA类似物, 其将正常DNA的磷酸二酯骨架由2-氨乙基-甘氨酸所取代. PNA较之传统的探针具有许多优点, 且可运用于实时定量PCR检测.

同行评价

本文选题较好, 具有一定的学术价值, 对胰腺疾病的鉴别诊断有重要的临床意义.

备注

编辑:李薇 电编:李薇

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