文献综述 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-03-28; 18(9): 902-905
在线出版日期: 2010-03-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i9.902
慢性HBV感染YMDD自然变异的研究进展
屈军校, 曾庆磊, 徐光华
屈军校, 曾庆磊, 徐光华, 延安大学附属医院感染病科 陕西省延安市 716000
基金项目: 延安市科技计划基金资助项目, No. 2007.
作者贡献分布: 屈军校与曾庆磊对此文所作贡献均等; 本文由徐光华审校.
通讯作者: 曾庆磊, 716000, 陕西省延安市, 延安大学附属医院感染病科. zengqinglei2009@163.com
电话: 0911-8261714
收稿日期: 2009-12-13
修回日期: 2010-01-18
接受日期: 2010-01-26
在线出版日期: 2010-03-28

HBV DNA聚合酶(polymerase, P)的变异主要发生在YMDD区域, 并与拉米夫定的耐药有关. 尽管这些变异株会在应用拉米夫定之后出现, 但是他们也会"自然产生". 很多学者都已证实了YMDD自然变异株的存在. 目前检测YMDD变异的方法有多种, 但还没有一个完全统一的方法. HBV YMDD变异可能与HBV DNA水平及其基因型等有一定的关系.

关键词: 乙型肝炎病毒; YMDD; 自然变异
引文著录: 屈军校, 曾庆磊, 徐光华. 慢性HBV感染YMDD自然变异的研究进展. 世界华人消化杂志 2010; 18(9): 902-905
Advances in research on natural YMDD mutations in the hepatitis B virus DNA polymerase in patients with chronic hepatitis B
Jun-Xiao Qu, Qing-Lei Zeng, Guang-Hua Xu
Jun-Xiao Qu, Qing-Lei Zeng, Guang-Hua Xu, Department of Infectious Diseases, the Affiliated Hospital of Yan'an University, Yan'an 716000, Shaanxi Province, China
Supported by: the Yan'an Municipal Science and Technology Program, No. 2007.
Correspondence to: Qing-Lei Zeng, Department of Infectious Diseases, the Affiliated Hospital of Yan'an University, Yan'an 716000, Shaanxi Province, China. zengqinglei2009@163.com
Received: December 13, 2009
Revised: January 18, 2010
Accepted: January 26, 2010
Published online: March 28, 2010

Mutations of the hepatitis B virus (HBV) DNA polymerase, mainly occurring in the YMDD region, are related to resistance to lamivudine. Although these mutations often occur after lamivudine use, they can also emerge naturally. Many scholars have demonstrated the existence of natural YMDD mutations. Although many methods are currently used to detect YMDD mutations, a unified approach for detection of YMDD mutations is still unavailable. The emergence of YMDD mutations may be associated with HBV DNA levels and genotypes.

Key Words: Hepatitis B virus; YMDD; Natural mutation
0 引言

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是我国最主要的慢性肝炎类型, CHB主要的治疗方法是抗病毒治疗. 目前抗HBV的药物主要有两大类, 一类是干扰素(interferon, IFN), 另一类是核苷类似物(nucleoside analogue, NA). IFN的疗效相对确定, 但不良反应相对多见, 且一般不用于某些病情(如失代偿期肝硬化). NA使用方便、价格相对低廉、疗效相对确切且耐受性较好, 其中拉米夫定目前在临床上应用最广; 但长期使用NA可导致HBV变异并对其产生耐药性. 主要是由于HBV在复制过程中要经过一个逆转录过程, 经逆转录形成HBV DNA的负链, 这一过程是在HBV DNA P的指导下完成的, 由于HBV DNA P缺乏校正功能, 所以HBV在复制过程中具有较高的自然变异率[1], 且每24 h可以产生3.2×1010-1011含有单一位点突变的HBV DNA[2]. 最常见的是HBV DNA P基因的酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)区域发生变异, 主要突变为YI(异亮氨酸)DD或YV(缬氨酸)DD, 即由YMDD变异为YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V), 在抗病毒药物的压力下变异率可能更高[3], 从而会影响抗病毒的疗效. HBV自然变异可能会对抗病毒治疗提出一定的挑战.

1 HBV感染发生其DNA P基因YMDD自然变异

在应用NA(特别是拉米夫定)之后易出现HBV DNA P基因的YMDD变异, 实际上有些患者体内HBV变异株与野生株共存, 只是野生株占优势, 不易被一般检测方法检测, 长期的药物作用抑制了野生株的复制, 此时耐药的变异株成了优势株, 临床上就会表现出耐药[4]. 近年日本学者检测18例未经拉米夫定和其他抗病毒药物治疗的HBV无症状携带者, 且ALT保持正常范围1年以上, 结果发现有5例发生了YMDD变异, 证明了HBV无症状携带者YMDD变异是自然存在的[5,6]. 韩国学者[7]报道40例未经拉米夫定治疗的CHB患者中发现有3例患者出现YMDD基因序列变异, 变异率为7.5%. 中国学者研究196例未经抗病毒治疗的CHB患者中有21例发生YMDD变异, 其中20例为YVDD变异、1例为YIDD变异[8]. 研究还发现肝硬化患者中也存在YMDD自然变异的现象, 变异率为26.41%[9]. 以上主要是东亚的报道, 而伊朗学者发现没有接受拉米夫定治疗的CHB患者YMDD变异率为0%[10].

2 HBV DNA P基因YMDD变异的检测方法
2.1 核酸序列分析

核酸的序列测定是所有其他快速简便检测变异技术的基础, 是最直接最基本的检测点变异的方法. 大部分测序的基本原理均采用Sanger发明的双脱氧DNA链末端终止法. 其基本原理为: DNA链在进行复制时, 在DNA P作用下以互补单链DNA为模板, 以带有3'-OH末端的单链寡核苷酸为引物, 不断地将4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)加到新生链的3'-OH末端, dNTP为单脱氧核糖核酸, 即脱去了第二位C原子上的氧原子, 而第三位C原子上的氧原子能够与另一dNTP第五位C原子上的磷酸基团形成3'、5'磷酸二酯键, 双脱氧核糖核酸(ddNTP)的第三位C原子上的氧原子也被脱去, 这样在DNA合成过程中, 他能够与正常核苷酸形成磷酸二酯键, 但由于其3'-OH中氧原子的脱去而不能与下一个核苷酸形成3'、5'磷酸二酯键, 延伸中的DNA链被终止. 所以在进行DNA延伸时当dNTP掺入时, 链能够继续延伸, 而当ddNTP掺入时, 链被终止, 由于ddNTP的掺入是随机的, 能够发生在链延伸的任何一点, 这样便形成相差仅一个碱基的大小不等的一系列DNA片段, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳, 放射自显影后即可读出所测DNA的序列. 这种直接测序是HBV测序的经典方法, 但是敏感性低, 只有当变异病毒占总病毒的25%以上时才能被检测到[11].

2.2 双寡聚核苷酸引物技术

此项技术为韩国Seegene公司的专利技术, 这种设计独特的双寡聚核苷酸引物(dual priming oligonucleotide, DPO)技术为多重PCR技术的应用提供了新的前景. DPO引物由5'端、多聚脱氧次黄嘌呤核苷区和3'端三部分组成. PCR扩增时, 多聚脱氧次黄嘌呤核苷区并不与模板结合, 而是形成了泡状突起, 使引物的5'端和3'端各具不同的功能: 5'端的18-25个碱基起始引物与模板结合起固定作用, 3'端的6-12个碱基决定着引物的特异性延伸, 两者相互作用, 既保证扩增的特异性, 又大大提高了扩增效率; DPO引物与模板发生错配的几率很小, 一旦有三个以上碱基错配, 就不会成功扩增[12]. 此方法通过简单的引物设计便极大地提高了PCR的敏感度与特异度, 应用DPO引物的这一特点该方法可用于检测基因突变, 采用此技术通过多重PCR可同时检测rtM204I/V/S和rtL180M变异, 检测灵敏度为1×103拷贝/mL, 能检测出最少2%的变异株[13,14]. 目前已开发出用于拉米夫定耐药检测的试剂盒. 此外这种基于DPO技术的多重PCR还可以用于幽门螺杆菌的检测[15]. 该方法具有较高的灵敏度和特异度, 操作简单, 性价比高, 将是一种很有前途的检测YMDD变异的方法.

2.3 MGB-Taqman探针实时PCR法

目前国内已有经国家食品药品监督管理局批准的用于检测拉米夫定耐药的试剂盒. Taqman探针是实时PCR常用的探针, 用于变异株的检测又称为3'核酸酶法. 将MGB(minor groove binder)结合到Taqman探针的3'端不仅可以有效提高探针的退火温度, 还可以显著降低错配序列与探针的退火温度, 使MGB-Taqman探针较普通Taqman探针在检测单核苷酸变异时具有更高的敏感性与特异性.该法检测YVDD和YIDD的灵敏度可精确到10和50拷贝, 最少能测出10%的变异株; 用该方法在一项21份样本的YMDD检测中, 有15例检测出YMDD变异株阳性, 而直接测序和反向杂交的阳性数分别为11例和9例; 提示MGB-Taqman探针实时PCR法是检测YMDD变异灵敏的准确的方法[16]. 研究发现该方法应用于YMDD多重变异更具临床意义[17].

2.4 扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)

ARMS于1989年建立, 是PCR技术应用的发展, 也有学者将其译为放大受阻突变系统, 也称等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification, ASA). 该方法是基于引物3'端错配PCR的方法, 如引物3'端碱基与模板错配会导致Taq酶扩增效率下降. 根据这个原理设计引物3'端与HBV耐药株序列互补而与野生株错配, 此时PCR反应将选择性扩增变异株, 这种方法称放大受阻突变PCR(ARMS-PCR), 该方法在105-109拷贝/mL的野生株病毒内可最低检测到0.01%变异株. 研究发现该方法联合分子信标技术可在YMDD变异株成为优势株前进行有效的预测[11].

不同的方法在灵敏度、特异性、性价比等方面各有优缺点, 虽然YMDD变异株的临床与科研需要检测方法标准化, 但是目前还不能确定哪一种方法是检测的"金标准".

3 HBV DNA P基因YMDD变异的相关性研究
3.1 HBV DNA P基因YMDD变异与部分血清学标志物水平的关系

在拉米夫定治疗中, 发生YMDD变异病例的HBV DNA载量明显高于无变异者, DNA载量小于105拷贝/mL的很少发生变异; 治疗前HBV DNA高载量提示治疗期间发生YMDD变异的概率要大, 所以治疗前的病毒载量对治疗中YMDD变异具有指示性作用, 且ALT与HBV DNA的相互关联能够指导临床对NA的合理应用[18-20]. 如果治疗前HBeAg阳性且ALT和DNA水平较高, 这种病例发生YMDD变异的可能性较大, 最终可能导致病情反弹[21].

3.2 HBV DNA P基因YMDD变异与HBV基因型的关系

P基因YMDD变异与性别、国家、家族聚集史没有直接关联, 跟病程和病情的严重程度有一定的关系; HBV的C基因型发生YVDD(rtM204V)变异100%伴随rtL180M变异, 其发生rtL180M/M204V明显高于B基因, 而且C基因型不发生点变异, rtM204I和rtL180M发生的点变异只存在于B基因型[20,22], 总体来说B基因型更易发生YMDD自然变异[8]. 与B基因型相比C基因型在发生耐药后HBV DNA的载量会更高, HBV基因型、治疗前ALT和DNA水平可作为独立的因素用于判断YMDD变异的模式[23].

4 结论

拉米夫定易导致HBV DNA P基因发生YMDD变异, 事实上有些患者体内HBV变异株与野生株共存, 只是野生株占优势, 一般的检测方法不易将其检测出来. YMDD的变异和自然变异与血清病毒载量等有一定的关系. 在应用NA抗病毒治疗前检测YMDD变异有重要意义, 但目前检测YMDD自然变异尚没有一个公认统一的标准.

评论
背景资料

慢性乙型肝炎(CHB)主要治疗方法是抗病毒治疗. 目前抗HBV的药物主要有两大类, 一类是干扰素(IFN), 另一类是核苷类似物(NA). IFN的疗效相对确定, 但不良反应相对多见, 且一般不用于某些病情(如失代偿期肝硬化). NA使用方便、价格相对低廉、疗效相对确切且耐受性较好, 其中拉米夫定目前在临床上应用最广; 但长期使用NA可导致HBV变异并对其产生耐药性. 主要是由于HBV在复制过程中要经过一个逆转录过程, 经逆转录形成HBV DNA的负链, 这一过程是在HBV DNA P的指导下完成的, 由于HBV DNA P缺乏校正功能, 所以HBV在复制过程中具有较高的自然变异率.

同行评议者

高润平, 教授, 吉林大学第一医院肝病科.

研发前沿

YMDD的变异和自然变异与血清病毒载量等有一定的关系. 在应用NA抗病毒治疗前检测YMDD变异有重要意义, 但目前检测YMDD自然变异尚没有一个公认统一的标准.

相关报道

最常见的是HBV DNA P基因的酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)区域发生变异, 主要突变为YI(异亮氨酸)DD或YV(缬氨酸)DD, 即由YMDD变异为YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V), 在抗病毒药物的压力下变异率可能更高, 从而会影响抗病毒的疗效. HBV自然变异可能会对抗病毒治疗提出一定的挑战.

同行评价

本文论述层次清晰, 文献复习全面, 对临床医生合理认识和使用核苷类似物抗病毒治疗具有指导意义.

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

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