文献综述 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-03-18; 18(8): 808-814
在线出版日期: 2010-03-18. doi: 10.11569/wcjd.v18.i8.808
大肠癌microRNA与DNA甲基化修饰相互调控的研究进展
王峰, 秦环龙
王峰, 秦环龙, 上海交通大学附属第六人民医院 上海市 200233
基金项目: 上海市科委基金资助项目, No. 07DZ19505.
作者贡献分布: 本文由王峰综述, 秦环龙审校.
通讯作者: 秦环龙, 主任医师, 200233, 上海市宜山路600号, 上海交通大学附属第六人民医院普外科. huanlong_qin@live.cn
电话: 021-64361369
收稿日期: 2009-12-23
修回日期: 2010-02-03
接受日期: 2010-02-09
在线出版日期: 2010-03-18

microRNA(miRNA)及DNA的甲基化修饰都属于表观遗传学的重要内容, 两者在肿瘤的发生发展中起着重要的作用. 目前发现, microRNA与DNA甲基化之间存在着复杂的相互调控机制. 本文将就两者在大肠癌中相互作用的研究进展进行综述, 旨在为大肠癌的研究提供新的思路.

关键词: 大肠肿瘤; miRNA; DNA甲基化; 表观遗传学
引文著录: 王峰, 秦环龙. 大肠癌microRNA与DNA甲基化修饰相互调控的研究进展. 世界华人消化杂志 2010; 18(8): 808-814
Reciprocal regulation between microRNAs and DNA methylation in colorectal cancer
Feng Wang, Huan-Long Qin
Feng Wang, Huan-Long Qin, Department of Surgery, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China
Supported by: the Foundation of Shanghai Municipal Science and Technology Commission, No. 07DZ19505.
Correspondence to: Huan-Long Qin, Department of Surgery, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, 600 Yishan Road, Shanghai 200233, China. huanlong_qin@live.cn
Received: December 23, 2009
Revised: February 3, 2010
Accepted: February 9, 2010
Published online: March 18, 2010

The research on the regulation of microRNAs (miRNAs) and DNA methylation belongs to the scope of epigenetics. Both microRNAs (miRNAs) and DNA methylation play an important role in the development and progression of human cancers. Recently, it has been demonstrated that there exist complex reciprocal regulatory mechanisms between microRNAs and DNA methylation. In this paper, we will give a review of the recent advances in understanding such reciprocal regulation in colorectal cancer, with an aim to offer new insight into the diagnosis and treatment of the disease.

Key Words: Colorectal cancer; MicroRNA; DNA methylation; Epigenetics
0 引言

大肠癌是最常见的消化系肿瘤之一. miRNA是新近发现的一类在动植物及病毒中广泛存在的单链非编码RNA, 鉴于其作用机制, 有学者[1]将其归入表观遗传学(epigenetics)的范畴. DNA甲基化异常是表观遗传学的重要内容. miRNA及DNA甲基化都与肿瘤的形成有着密切的联系[2,3]. 目前研究发现, 他们之间的相互调控在肿瘤的发生、发展进程中同样发挥了十分重要的作用. 本文就大肠癌中两者相互作用的研究进展作一综述.

1 microRNA概述及在大肠癌中的表达

miRNA的编码基因首先转录产生1 000 bp左右的初级产物(pri-miRNA), 后者在细胞核内被RNaseⅢ内切酶家族的Drosha酶进一步切割成70 bp左右的发夹状前体(pre-miRNA), 该前体在exportin-5蛋白的作用下转运至细胞质, 然后经Dicer酶切割成约22 nt的成熟miRNA. 成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)的引导下, 与靶mRNA3'端非翻译区(3'UTR)完全或不完全匹配结合, 诱导靶mRNA降解或阻遏其翻译, 从而在转录后水平沉默基因的表达, 并通过细胞内复杂的调控网络对细胞发育、分化、增殖与凋亡等进行精确调节[4,5].

miRNA对mRNA的沉默方式取决于两者特异性结合的程度[6]. 大多数的植物miRNA可以与靶序列完全匹配而进入RNA干涉途径降解靶分子; 而绝大多数哺乳动物miRNA与靶mRNA的3'UTR序列不完全配对, 通过RISC复合体降低靶基因蛋白的表达, 在转录后翻译水平抑制靶基因的表达.

越来越多的研究证实, 正常组织与肿瘤组织中miRNA的表达存在显著的差异, miRNA在肿瘤的发生、发展中起着重要的调控作用[7,8]. 目前的研究表明, 大肠癌相关miRNA达几十种之多(表1). miRNA具有促癌和抑癌的作用, 这取决于他们在细胞中的表达方式以及在细胞恶性转化进程中的作用[9]. Kumar等[10]在研究包括大肠癌在内的多种人类肿瘤细胞中miRNA的表达调控时发现, miRNA的普遍抑制(global inhibition)可引起细胞成瘤性的增加并导致肿瘤的形成. Monzo等[11]发现, miR-17-5p及其靶分子E2F转录因子1(E2F transcription factor 1, E2F1)在人类结肠的早期胚胎发育和肿瘤的发生中存在着相似的表达模式, 且肿瘤的恶性程度越高, 其表达模式越接近胚胎中的表达. 提示胚胎发育期, 结肠组织中miR-17-5p的高表达通过下调E2F1的表达促进细胞的增殖; 而结肠癌发生过程中miR-17-5p的表达重新被激活, 并导致了细胞的恶性增殖.

表1 大肠癌中miRNA的表达概况.
上调miRNA预测靶点下调miRNA预测靶点
let-7blet-7an
let-7gTGFR2miR-10an
miR-9TCF4, MSH2miR-15b
miR-17-3pmiR-23a
miR-17-5pmiR-25
miR-21miR-27a
miR-26amiR-27b
miR-29b-2miR-30c
miR-30a-3pmiR-34b/cn
miR-30a-5pmiR-107
miR-31miR-124anCDK6, Rb
miR-96K-RasmiR-125a
miR-124bMLH1miR-125bVEGF
miR-128bIGFR1, VEGFR
miR-132miR-127
miR-135aMSH2miR-130aTGFR2
miR-133aBAX, K-Ras
miR-135bmiR-133bK-Ras
miR-141APC, MSH2miR-134
miR-142-3pmiR-137TGF2I
miR-142-5pmiR-143
miR-181amiR-145TGFR2, APC
miR-181bmiR-147
miR-182IGFR1miR-154MLH1
miR-183miR-191
miR-194miR-199a
miR-200aMSH2miR-199b
miR-200bMLH1miR-214TP53, β-catenin TGFR2, BAX
miR-200cMLH1, SMAD2CDKN2b, EGFR
miR-203miR-296
miR-205K-Ras, SMAD4miR-299β-catenin,
MSH2, PTENCDKN2a
miR-337
miR-215miR-339
miR-219TGFR2miR-342n
miR-368
miR-320miR-370BAX, AKT1
miR-338miR-582
miR-372TGFR2, SMAD2
MLH1, AKT1
n可被DNA甲基化调控.

大肠癌中miRNA的表达与临床病理特征及肿瘤的预后存在相关性. 研究者检测197例结肠癌组织中miRNA的表达并结合病例随访发现, 37种miRNA的表达存在差异, 其中miR-20a、miR-21、miR-106a、miR-181b及miR-203的表达升高, 而又以miR-21的升高最显著, 且其在结肠癌中的高表达与较差的分化、较差的化疗疗效及较低的生存率相关[12]. Kopetz等[13]发现, miR-320和miR-498的表达与Ⅱ期大肠癌患者无进展生存期(progression- free survival, PFS, 指从开始对肿瘤进行针对性治疗直至肿瘤出现继发进展生长的时间跨度, 是肿瘤治疗的临床研究常用的权衡指标之一)有关, 两者高表达的患者, 其PFS明显缩短. Schepeler等[14]对49例Ⅱ期大肠癌的肿瘤标本进行检测发现, miR-142-3p、miR-212、miR-151及miR-144四种miRNA的差异性表达可以将受检的大肠癌分成微卫星稳定(microsatellite stable, MSS)及不稳定型(microsatellite stable, MIS), 其准确率、特异性和敏感性分别为84%、81%和92%. 这两种类型区分的意义在于, 微卫星不稳定型具有较好的预后, 而其化疗的效果较差.

鉴于miRNA在大肠癌中的重要作用, 研究其调节机制对于揭示肿瘤的发生发展及制定相关的治疗策略有重要意义. 近年来, miRNA与DNA甲基化的关联性报告明显增多, 越来越多的研究表明, 两者之间存在着复杂的相关调节机制.

2 大肠癌中miRNA与DNA甲基化修饰的相互作用

miRNA的表达调控可以发生在转录水平, 也可发生在转录后的加工成熟阶段. miRNA编码基因启动子序列的CpG岛可以发生DNA的甲基化, 而甲基化所导致表达沉默即是在转录水平对miRNA进行调节; 此外, Michael等[15]还发现, 大肠癌和腺瘤组织中miR-143和miR-145的表达均减少, 而pre-miR-143水平却没有显著的变化, 这提示miR-143的表达在转录后(post-transcriptional)受到调节而下调. 目前研究显示, 与mRNA相似, pri-miRNA也具有7-甲基鸟嘌呤核苷帽结构和多聚腺苷酸尾部[5], 且人类miRNA编码基因中约有47%与CpG岛相关[16]. 这些都提示: miRNA可能像一般的蛋白编码基因一样, 可以被DNA甲基化等表观遗传修饰调控.

与此同时, miRNA分子也可以调控表观遗传作用. DNA甲基化转移酶(DNMT)催化S-腺苷甲基硫胺酸(SAM)的甲基基团转移至胞嘧啶上, 在甲基化过程中发挥关键作用. miRNA可以通过调节DNMT的表达进而调节DNA的甲基化.

2.1 甲基化调控miRNA在大肠癌中的表达

2.1.1 CpG岛甲基化调控miRNA的表达: 哺乳动物中, DNA的甲基化发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上. CpG按一定的含量成簇地出现形成CpG岛. 人类基因组中大约包括38 000个CpG岛, 70%已知基因的5'端调节区有CpG岛存在[17]. 在人体正常细胞中, 多数与基因表达有关的CpG岛未被甲基化, 而只有富含CpG重复序列和逆转录因子(retroelements)被彻底地甲基化. 在肿瘤形成过程中, 这种模式发生了改变[18], 出现了基因间重复序列的低甲基化和编码区域CpG的高甲基化. Lujambio等[19]比较了结肠癌细胞HCT-116的野生型和DNA甲基化酶DNMT1/3B基因双敲除(DKO)型细胞中miRNA的表达, 发现缺乏DNMT的细胞中, 18/320的miRNA表达升高3倍以上, 其中miR-124a、373、200c、130b及517c这5种miRNA包埋于典型的CpG岛内, 而miR-124a所处的CpG岛在DKO细胞中被特异性的甲基化. 随后, 研究者在大肠癌组织中也发现了相当比例甲基化的miR-124a, 并证实甲基化导致的miR-124a表达减少可以诱导下游CDK6的激活, 继而引起Rb蛋白的磷酸化, 促使肿瘤发生. CpG岛甲基化调节miRNA的表达与大肠癌临床病理特征存在相关性. Grady等[20]发现, 去甲基化剂作用后, 大肠癌细胞中has-miR-342的表达上调, 并且肿瘤细胞的凋亡明显增加. 在检测40种其他类型的肿瘤细胞中, 只在一种肺癌细胞中检测到has-miR-342的部分甲基化, 这说明has-miR-342的甲基化失活具有大肠癌特异性. Bandres等[21]在大肠癌细胞系中发现了表达下调的has-miR-9、has-miR-129及has-miR-137, 采用甲基化特异性PCR(MSP)及亚硫酸盐测序分析发现, 其中has-miR-9的表达与CpG岛的甲基化水平呈反比, 且与淋巴结转移存在相关性. Lujambio等[22]发现, 包括结肠癌淋巴结转移细胞系中, miR-148a、miR-34b/c及miR-9由于启动子CpG岛的甲基化而表达下调, 而他们相应靶点如C-MYC、E2F3(E2F transcription factor 3)、CDK6和TGIF2(TGFB-induced factor homeobox 2)的表达随之升高, 并与肿瘤的转移能力相关.

2.1.2 去甲基化或低甲基化作用调控miRNA的表达: DNA的去甲基化通过作用于基因的重复单元(repetitive elements)、逆转座子、缺乏CpG的启动子、内含子及基因沙漠(gene desert)等引起染色体的重构和基因的易位, 进而影响基因的稳定性[23-26]. 其同样也参与miRNA的调控. 正常情况下, 细胞中的let-7a-3所在CpG岛高度甲基化而致其失活, 肺癌细胞中则出现了相应CpG岛的低甲基化, 并导致let-7a-3的激活, 激活的let-7a-3使得近200个基因调节障碍, 参与肿瘤的形成[27]. 可见, 低甲基化或去甲基化作用也可以增加miRNA分子的表达, 并参与肿瘤的形成. 这种现象在大肠癌中尚未发现, 但其提示DNA甲基化调控miRNA表达的复杂性.

2.1.3 miRNA的甲基化调控的影响因素: miRNA的甲基化同时受到其他因素的调控. MBP家族中的甲基化CpG结合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2, MeCP2)通过结合于甲基化的CpG而抑制基因的表达[28]. Nomura等[29]发现, 磷酸化导致的去极化作用可以解除其与CpG的结合, 并引起miR-184的表达上调. 有实验表明, 基因中单个核苷酸改变引起了pre-miRNA结构的变化. Bemis等在黑色素瘤细胞中发现[30], pri-miRNA中核苷酸串联重复序列变异(VNTR)影响了成熟miRNA的表达和功能. 谷胱甘肽-S-转移酶P1(glutathione S- transferase P1, GSTP1)与包括大肠癌在内的多种肿瘤的化疗耐药相关[31], Ronneberg等[32]发现, 乳腺癌细胞GSTP1启动子区域存在ATAAA重复片段的变异和四种单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs), 这些序列的变化导致转录因子c-Myb结合位点的改变, 影响GSTP1转录的活性. 而其转录活性的改变导致启动子区域DNA甲基化的改变. Hazra等[33]发现, 大肠癌中参与一碳代谢途径的某些基因的单核苷酸多态性, 如rs1801131及rs1801198与启动子CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)相关, 也就是说这两种SNPs可以影响细胞某些基因的甲基化. 可见, 核苷酸串联重复序列变异及单核苷酸多态性可能参与了miRNA的甲基化调节. 以上结果均提示, 大肠癌的发生发展中, 异常DNA甲基化修饰可以通过类似于调节mRNA甲基化的方式对miRNA的表达进行调控.

2.2 大肠癌中miRNA对DNA甲基化的影响

随着研究的不断深入, 人们发现, miRNA作为表观遗传的重要方面, 参与了对DNA甲基化的调控. Lewis等[34]预测的miRNA分子调节靶点中, 包括了组蛋白甲基化转移酶、MBPs、染色体区域结合蛋白和组蛋白去乙酰化酶, 这些蛋白产物涉及包括DNA甲基化在内的表观遗传的调节过程. Bao等[35]最初在植物中发现, 基因启动子区域CpG岛的甲基化过程需要miRNA的参与; Ting等[36]研究缺乏Dicer的结肠癌细胞系发现miRNA参与了抗分泌型卷曲相关蛋白-4(secreted frizzled-related protein 4, SFRP-4)编码基因CpG岛的甲基化作用.

2.2.1 miRNA调节DNA甲基化的关键酶: DNA的甲基化由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)介导, 该酶包括3种亚型: DNMT1、DNMT3A和DNMT3B, 他们从S-腺苷-L-蛋氨酸中转移一个甲基到CpG二核苷酸的胞嘧啶上, 介导DNA的甲基化[37]. 传统观点认为, DNMT1主要维持体细胞中DNA甲基化的状态, 而DNMT3A/3B则负责DNA甲基化的从头合成; 但目前的研究表明, 他们都具有这两种作用[38]. miRNA可以通过调节DNMT影响DNA的甲基化. Ng等[39]利用大肠癌细胞中miR-143为研究对象, 观察miRNA与DNA甲基化转移酶以及细胞甲基化的关系. 发现大肠癌肿瘤组织中miR-143的表达与DNMT3A基因mRNA及蛋白的表达呈负相关(r = -0.59, P = 0.0066), 通过计算机预测发现, DNMT3A可能是miR-143的作用靶点. 随后, 他们从大肠癌细胞中克隆DNMT3A基因mRNA的3'UTR序列, 并将该序列插入到pGL3-promotor载体上荧光素酶基因下游, 部分插入后的3'UTR经基因定点突变试剂盒作用, 致其种子序列发生点突变作为对照, 随后将带有突变及野生型3'UTR序列的pGL3-promotor载体与miR-143共转染结肠癌细胞系228和SW480. 结果发现, 带有野生型3'UTR序列的载体和miR-143共转染的肿瘤细胞表现出了显著增强的荧光活性, 而发生突变的3'UTR序列则不与miR-143结合. 这说明, miR-143将DNMT3A作为直接作用靶点, 而抑制DNMT3A的表达; 随后, 通过转染增加大肠癌细胞miR-143的表达可以引起DNMT3A基因mRNA显著降低, 并抑制了肿瘤细胞的生长, 而使用siRNA沉默DNMT3A基因同样使肿瘤细胞的生长受到抑制. 这说明, miR-143将DNMT3A作为直接作用靶点, 而抑制其的表达, 发挥抑癌作用, 大肠癌中miR-143的表达下调, 促进了肿瘤的发生. 还有研究表明, miRNA可以通过其他靶点而间接作用于DNMT, 从而调节DNA的甲基化. Benetti等[40]研究Dicer缺陷小鼠胚胎干细胞的甲基化调节时发现, Dicer的缺乏导致的miR-290表达下调, 可以引起其下游靶点Rbl2的表达上调, 后者作为甲基化转移酶Dnmt3A和3B的抑制因子, 抑制了这两种酶的表达, 进而导致细胞基因组甲基化水平降低, 并引起端粒的异常重构和延长. miRNA还可作用于组蛋白修饰过程中的甲基化转移酶而调节组蛋白氨基酸基团的甲基化, 影响基因的表达. Wang等[41]发现, B细胞转化型慢性淋巴细胞白血病中, miR-19a等特异性miRNA的下调导致蛋白精氨酸甲基转移酶PRMT5(protein arginine methyl- transferases)的表达增高, 后者介导RB抑癌基因家族中RB1、RBL1及RBL2启动子区域组蛋白的甲基化, 从而导致其表达减少. Varambally等[42]发现, miR-101的下调导致组蛋白甲基转移酶EZH2的表达增加, 后者介导靶基因启动子组蛋白H3的赖氨酸27(H3K27)的甲基化, 导致基因沉默, 参与肿瘤的进展.

2.2.2 其他: 除了对甲基化转移酶的作用, miRNA还可以通过其他机制调节DNA的甲基化. Bao等[35]研究拟南芥植物发现, 胞质中成熟的miRNA可进入细胞核与转录的mRNA配对, 并结合其他因子而形成非特异性染色质重构复合物(unspecified chromatin remodeling complex), 诱导基因启动子的甲基化. Ting等[36]发现, 在结肠癌细胞系HCT116中, 突变的Dicer可以引起一些基因启动子区域的去甲基化改变, 而在此过程中, DNMTs的活性并未受到影响. 提示miRNA或是其他类型的非编码RNA分子, 通过调节DNMTs以外的途径参与了细胞DNA的甲基化调节[37].

3 两者的相互调控与肿瘤相关信号传导通路的关系

越来越多的研究表明, miRNA通过大肠癌相关的信号传导通路发挥作用, 其中包括Wnt/β-catenin通路、EGFR(KRAS及磷脂酰肌醇-3激酶)通路、P53通路、IGF通路等[43,44]; 另外, 许多信号通路的共有成分, 如c-Myc、COX-2等也与miRNA存在相互调控[45]. 同样, miRNA与DNA甲基化之间的调控与这些信号传导通路也存在关联. Toyota等[46]发现, 作为P53直接作用靶点的miR-34b/c在大肠癌中表达受DNA甲基化的调节. 他们先用甲基转移酶抑制剂处理大肠癌细胞系, 然后检测其中137种miRNA的表达, 发现mir-34b/c的表达明显上调, 而mir-34b/c编码基因的上游存在密集的CpG岛, 在大肠癌组织及细胞系中甲基化也是广泛存在的. 去甲基化剂作用后可以重新激活miR-34b/c的表达, 而抑制其下游靶蛋白肝细胞生长因子受体(c-Met)、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)和SFRS2(splicing factor arginine/serine-rich 2)的表达, 其中, CDK4是P53的作用靶点, 而MET和SFRS2都与P53调节网络有关, 提示DNA甲基化导致的mir-34b/c失活通过P53网络的作用来促进大肠癌的发生发展. Benetti等[40]发现miR-290对Dnmt3A和3B的调控中, 作为甲基化转移酶抑制因子而起中介作用的Rbl2, 属于Rb家族成员, 同样参与细胞周期的网络调控.

4 结论

大肠癌miRNA与DNA的甲基化相互调控机制的研究还刚起步, 还存在着许多问题. 比如, 大肠癌作为一种异质性的肿瘤, 包括许多的亚型(DNA微卫星稳定及不稳定型、CpG高甲基化型及低甲基化型等), 而不同亚型之间两者的相互调控有什么差异, 差异有什么意义尚有待于深入的研究; 此外, 大肠癌的发生是一个多阶段的演进过程, 两者的调控在哪个阶段发挥作用、谁是启动因素、确切的作用机制以及同细胞调控网络的相互作用等问题尚待研究解决.

评论
背景资料

表观遗传是指细胞内的基因型未发生变化而表型却发生了改变的遗传现象, 主要涉及DNA甲基化、非编码RNA等方面的调控; 大肠癌是最常见的消化系肿瘤之一. 近年来研究表明, 表观遗传在大肠癌的发生发展中起到了重要的作用, 对其深入研究将为认识和治疗肿瘤提供新的思路.

同行评议者

李玉民, 教授, 兰州大学第一医院普外科

研发前沿

miRNA是新近发现的一类在动植物及病毒中广泛存在的单链非编码RNA, 其与DNA甲基化都属于表观遗传学的范畴, 且都与肿瘤的形成有着密切的联系. 目前发现, 他们之间的相互调控在肿瘤的发生、发展进程中同样发挥了十分重要的作用, 两者之间相互作用的机制有待进一步的研究发现.

相关报道

编码基因启动子区域CpG岛的DNA甲基化可以影响miRNA的表达, 而miRNA则可通过调节甲基化的关键酶作用于DNA甲基化, 两者之间的相互调控同时还受到多种因素的作用.

创新盘点

本文综述了大肠癌相关的microRNA与DNA甲基化相互作用及意义, 并探讨了相关调控因素及在肿瘤相关信号通路中的作用, 旨在为大肠癌的诊治提供新的思路.

应用要点

本文有助于深入理解miRNA及DNA甲基化在大肠癌发生发展中的作用机制, 从而为研究大肠癌的发病机制提供新的思路, 同时也为大肠癌的治疗开拓了新的视野.

同行评价

本文选题新颖, 层次分明, 表达准确, 对大肠癌的研究有一定的指导意义.

编辑:李军亮 电编:何基才

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