临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-10-28; 18(30): 3249-3253
在线出版日期: 2010-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i30.3249
IFN-γ对人胃腺癌Survivin分子通路的调控作用
邓昊, 黄萱, 高友晶, 镇鸿燕, 刘丽江
邓昊, 镇鸿燕, 江汉大学病理诊断所 湖北省武汉市 430056
黄萱, 高友晶, 江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室 湖北省武汉市 430056
刘丽江, 江汉大学肿瘤研究所 湖北省武汉市 430056
基金项目: 武汉市青年科技晨光计划基金资助项目, No. 20045006071-7;湖北省自然科学基金资助项目, No. 2006AB191.
作者贡献分布: 此课题由邓昊与刘丽江设计; 研究过程由邓昊与黄萱操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由高友晶提供; 数据分析由邓昊与镇鸿燕完成; 本论文写作由邓昊完成.
通讯作者: 刘丽江, 教授, 430056, 湖北省武汉市, 江汉大学肿瘤研究所. liulijiang@163.com
电话: 027-84226503 传真: 027-84226503
收稿日期: 2010-06-08
修回日期: 2010-08-10
接受日期: 2010-08-17
在线出版日期: 2010-10-28

目的: 探讨胃癌中可能存在的Survivin通路以及IFN-γ对该通路可能存在的调控.

方法: 人胃癌组织经免疫组织化学染色行相关性分析, SGC7901细胞经IFN-γ及Survivin反义寡核苷酸处理, 应用RT-PCR和免疫细胞化学及图像分析的方法检测mRNA及蛋白水平的改变, 应用Hoechst33258染色观察细胞凋亡. 组织学指标相关性采用Spearman等级相关分析, 平均光密度值采用t检验分析.

结果: 人胃癌组织中Survivin与caspase-7正相关(P = 0.03); p21waf与caspase-7正相关(P = 0.02); 胃癌SGC7901细胞, 经不同浓度Survivin反义寡核苷酸处理后, Survivin蛋白表达明显下降(P<0.05), caspase-7和p21waf无明显变化. 经IFN-γ处理后, Survivin mRNA表达明显下降(P<0.05), p21waf和caspase-7 mRNA表达明显上升(P<0.05). 经IFN-γ和Survivin反义寡核苷酸处理后细胞无明显凋亡.

结论: 胃癌中Survivin表达与caspase-7及p21waf相关, 但不能通过调节caspase-7及p21waf的表达发挥其抑制凋亡作用; IFN-γ可使Survivin表达下调, 同时上调其下游促凋亡分子caspase-7以及p21waf的表达, 以发挥其生物学作用.

关键词: 生存素; caspase-7; p21waf; 干扰素-γ; 胃腺癌
引文著录: 邓昊, 黄萱, 高友晶, 镇鸿燕, 刘丽江. IFN-γ对人胃腺癌Survivin分子通路的调控作用. 世界华人消化杂志 2010; 18(30): 3249-3253
Regulatory effect of IFN-γ on the survivin signaling pathway in gastric adenocarcinoma
Hao Deng, Xuan Huang, You-Jing Gao, Hong-Yan Zhen, Li-Jiang Liu
Hao Deng, Hong-Yan Zhen, Institute of Diagnostic Pathology, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei Province, China
Xuan Huang, You-Jing Gao, Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei Province, China
Li-Jiang Liu, Tumor Institute, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei Province, China
Supported by: the Young Chenguang Foundation of Wuhan, No. 20045006071-7; and the Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2006AB191.
Correspondence to: Professor Li-Jiang Liu, Tumor Institute, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei Province, China. liulijiang@163.com
Received: June 8, 2010
Revised: August 10, 2010
Accepted: August 17, 2010
Published online: October 28, 2010

AIM: To characterize the role of survivin in the pathogenesis of gastric adenocarcinoma and to investigate the regulatory effect of interferon-γ (IFN-γ) on the survivin signaling pathway in gastric adenocarcinoma.

METHODS: Protein expression was examined by immunohistochemistry. After IFN-γ and antisense oligonucleotide against survivin were used to treat SGC7901 cells, mRNA and protein expression was tested by RT-PCR and immunocytochemistry, respectively, and apoptosis was determined by Hoechst 33258 staining. Statistical analysis was performed using the Spearman's rank correlation test and student's t-test.

RESULTS: There was a positive correlation between caspase-7 and survivin expression (P = 0.03) as well as between caspase-7 and p21waf (P = 0.02) expression in gastric adenocarcinoma. Treatment with survivin antisense oligonucleotide down-regulated the protein expression of survivin (P < 0.05) but had no significant impact on caspase-7 and p21waf protein expression (both P > 0.05). IFN-γ treatment down-regulated the mRNA expression of survivin (P < 0.05) but up-regulated the mRNA expression of caspase-7 and p21waf (both P < 0.05). Treatment with either IFN-γ or survivin antisense oligonucleotide had no significant impact on cell apoptosis.

CONCLUSION: Although the expression of survivin is correlated with that of caspase-7 and p21waf, survivin can not regulate apoptosis in gastric adenocarcinoma by regulating caspase-7 and p21waf expression. IFN-γ can regulate apoptosis in gastric adenocarcinoma by down-regulating survivin expression and up-regulating caspase-7 and p21waf expression.

Key Words: Survivin; Caspase-7; p21waf; Interferon-γ; Gastric adenocarcinoma
0 引言

胃癌是严重威胁中国人群健康的恶性肿瘤之一. 临床资料和实验研究显示: 胃癌细胞的凋亡明显受阻[1]; 34.5%胃癌组织不同程度表达生存素(Survivin), 且其表达水平与胃癌凋亡指数呈负相关[2]. Survivin是迄今发现作用最强的肿瘤细胞凋亡抑制因子之一, 可通过不同途径保护细胞周期不受checkpoint调控, 并抑制内、外源性因素(如BAX、Fas和化疗药物等)所诱导的肿瘤细胞凋亡[3]. Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的成员, 其具有调节细胞分化以及抑制凋亡的双重功能[4]. IAP家族最早是在对杆状病毒的研究中发现的, 具有在宿主细胞受到病毒感染时抑制其死亡的功能[5,6]. IAP家族是一个高度保守的抑制细胞死亡的家族, 其结构特征是, 具有1个到多个接近70个氨基酸的锌指结构, 即杆状病毒IAP重复序列(the baculoviral IAP repeat, BIR)[7], 该结构被认为与抗凋亡功能有关. Survivin是分子最小的仅有一个BIR结构的IAP家族成员[8]. 与IAP家族其他成员不同的是, Survivin在有丝分裂时表达达到峰值[9], 在胎儿组织中大量表达[4,10], 而在正常的分化成熟的组织中无表达[11], 在恶性肿瘤组织中过度表达. Survivin抑制凋亡的主要作用机制为: (1)Survivin直接与caspase-3和caspase-7结合, 通过抑制其酶活性而抑制凋亡[12]; (2)Survivin与细胞周期调节因子CDK4结合为复合物, 使p21waf从p21waf/CDK4复合物中释放, 并形成procaspase-3/p21waf复合物, 抑制procaspase-3水解为活化的caspase-3, 从而抑制凋亡[13]; (3)可在有丝分裂前期与纺锤体微管结合, 分裂中后期与纺锤体全长结合, 分裂末期与颗粒体结合, 通过保护有丝分裂过程中纺锤体和颗粒体的完整性, 间接抑制caspase对纺锤体的水解作用, 从而抑制细胞凋亡[14]. 近期的研究发现: 分别向胃癌细胞系HS-746T和MKN-45中导入Survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON), 胃癌细胞凋亡均明显增强[15,16]. 胃癌中Survivin的表达具有重要的临床意义[17,18], 但Survivin在胃癌中抑制凋亡的分子机制, 尚未明确. IFN-γ是Ⅱ型IFN中的唯一成员, 可促进肿瘤细胞凋亡[19], 所涉及的主要环节可能是IFN-γ可通过膜受体途径上调p21waf和caspase-7的表达而实现对细胞生长的调节[20,21]. 在前期研究中, 我们发现人胃腺癌中存在该现象[22]. Survivin和IFN-γ均可通过p21waf和caspase-7分子调控细胞凋亡, 提示IFN-γ信号途径可能存在对Survivin的调节作用或者两者之间存在相关性, 但胃癌中该方面的研究较少. 据此, 本研究拟首先通过临床病理学方法, 对人胃癌组织中Survivin、p21waf和caspase-7表达情况进行检测, 观察三者在人体组织中的相互关系; 其次, 通过细胞生物学及细胞病理学的方法, 使用Survivin ASON对胃癌细胞系SGC7901进行处理, 观察Survivin等分子在Survivin表达量改变时的变化及相互关系以及细胞凋亡情况, 以进一步明确人胃癌中存在的Survivin分子通路, 继而使用IFN-γ对胃癌细胞系SGC7901进行处理, 观察细胞凋亡以及Survivin和其相关分子的变化及相互关系, 探讨胃癌中IFN-γ对Survivin通路可能存在的调控作用.

1 材料和方法
1.1 材料

收集江汉大学附属医院1989-2003年胃腺癌根治性手术切除并有完整病理学检查数据的标本102例. 所有病例术前均未进行放疗和化疗. 胃癌细胞株SGC7901用含10%小牛血清(Gibcol)的RMPI 1640培养基(Gibcol), 置于37 ℃, 50 mL/L CO2的培养箱中培养. 每2-3 d换1次液.

1.2 方法

1.2.1 ASON转染以及药物处理: ASON及引物由赛百胜生物技术有限公司合成. 用阳离子脂质体Transfectin(TianGENE)进行转染. ASON的序列设计以及浓度根据已发表的文献. Survivin ASON: 5'-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3', 按照200和400 nmol/L的浓度转染[23], 处理细胞24 h. 细胞转染严格按照说明书操作, 反义寡核苷酸:脂质体 = 1:2-3. 使用1 000 IU/mL IFN-γ[24](102CY27, PEPROTECH EC)处理细胞0.5、3和24 h.

1.2.2 免疫组织化学及免疫细胞化学染色: 免疫组织化学及免疫细胞化学染色使用抗体为: 抗Survivin多克隆抗体(RAB-0536, Neomarker公司产品), 即用型鼠抗人caspase-7单克隆抗体(7CSP01, Neomarker公司产品), 即用型鼠抗人p21waf单克隆抗体(F-5, Santa Cruz, sc-6246)和SP法即用型检测试剂盒均购自福州迈新生物公司. 所有染色均经DAB显色. Survivin、caspase-7和p21waf以癌细胞质内呈棕黄色表达为阳性. 操作过程严格按照说明书要求进行. 各细胞处理组免疫细胞化学染色步骤保持严格一致, 并同时进行操作, 染色结果经MOTIC图像分析系统(Med-6)测量其平均光密度, 进行相对定量.

1.2.3 RT-PCR检测及图像分析: 用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA, 样品纯度和浓度经核酸测定仪测定, A260/280值在1.8-2.0. 严格按照RT-PCR试剂盒(TaKaRa)说明书操作进行RT-PCR. 使用Primer 5.0引物设计软件分别设计Survivin、caspase-7、p21waf和β-actin的上游和下游引物(表1). 目的引物与β-actin用一管法进行PCR. PCR产物经1.5 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测, 使用Biostep Photoimpact软件分析各组目的基因与β-actin条带的平均光密度值, 计算两者的比值, 进行相对定量.

表1 经Primer 5.0软件设计的引物序列.
基因正义链反义链长度(bp)
Survivin5'-CAGACTTGGCCCAGTCTTTC-3'5'-TTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3'236
caspase-75'-ATTTGACAGCCCACTTTAGG-3'5'-GCATGATTTCCAGGTCTTTT-3'297
p21waf5'-GCGACTGTGATGCGCTAATGG-3'5'-TAGAAATCTGTCATGCTGGTCTGC-3'358
β-actin 15'-TGCTGTCCCTCTACGCCTCT-3'5'-GCTTCTCCTTGATGTCGC-3'234
β-actin 25'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'318

1.2.4 Hoechst33258染色检测细胞凋亡: 无菌条件下取出细胞爬片并固定后, Hoechst33258孵育15 min, 0.01 mol/L PBS洗5 min. 水溶性封片剂封片, 荧光显微镜紫外光下观察, Hoechst33258染料呈现蓝色荧光. 高倍镜下观察, 凋亡细胞为蓝色亮点, 亮度明显强于未凋亡细胞, 形态学上出现核膜消失、核固缩、核碎裂等特征. 随机数取1 000个细胞进行凋亡细胞数的判定.

统计学处理 全部数据经SPSS12.0统计学软件处理, 相关因素分析采用Spearman等级相关分析, 各组平均吸光度值采用t检验分析. P<0.05有统计学意义.

2 结果
2.1 胃癌组织Survivin、caspase-7、p21waf分子表达之间的关系

全组102例胃癌, 男69例, 女33例. 年龄26-77岁, 中位年龄59岁. Survivin阳性率为51%(52/102), caspase-7阳性率为35.3%(36/102), p21waf阳性率为79.4%(81/102). 各指标表达情况经Spearman等级相关分析显示: Survivin与caspase-7正相关(P = 0.03, r = 0.21); p21waf与caspase-7正相关(P = 0.02, r = 0.22).

2.2 Survivin ASON处理后Survivin、caspase-7、p21waf蛋白表达的变化

经Survivin ASON 200和400 nmol/L浓度抑制Survivin的表达后, Survivin蛋白表达量在200 nmol/L组(P = 0.0005)和400 nmol/L组(P<0.0001)较未处理组出现不同程度的降低. 且降低程度有浓度依赖性(P = 0.0005). caspase-7表达量在200 nmol/L组(P = 0.9)和400 nmol/L组(P = 0.7)较未处理组无明显变化. p21waf表达量在200 nmol/L组(P = 0.72)和400 nmol/L组(P = 0.11)较未处理组无明显变化(图1).

图1
图1 SGC7901细胞经IFN-γ 1 000 IU, Survivin ASON 200、400 nmol/L处理24 h后, Survivin、caspase-7、p21waf蛋白表达的变化. A: Survivin; B: caspase-7; C: p21waf. 1: 对照组; 2: IFN-γ处理组; 3: ASON 200 nmol/L组; 4: ASON 400 nmol/L组.
2.3 IFN-γ处理0.5、3和24 h后Survivin、caspase-7、p21waf mRNA表达的变化

胃癌细胞SGC7901经IFN-γ处理0.5、3和24 h后, Survivin mRNA表达量下降(P<0.0001), caspase-7和p21waf mRNA的表达量均上升(均P = 0.03), 且均出现先下降后上升的趋势(图2).

图2
图2 IFN-γ刺激SGC7901细胞0. 5、3和24 h后Survivin、caspase-7、p21waf mRNA表达变化. A: Survivin; B: caspase-7; C: p21waf.
2.4 细胞凋亡的变化

SGC7901胃癌细胞在未处理组、IFN-γ处理组、Survivin ASON 200 nmol/L组和Survivin ASON 400 nmol/L组中, 凋亡细胞数无明显变化(P>0.05).

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 一经发现多为进展期, 5年生存低. 胃癌细胞凋亡率较低,且Survivin表达水平与胃癌凋亡指数呈负相关[2]. Survivin是IAP家族的成员具有强抑制凋亡作用. Survivin主要存在与胚胎期及婴儿期, 在成熟的组织中完全下调或消失, 但是在恶性肿瘤中又会出现.

本研究在人体胃癌组织中发现Survivin与caspase-7正相关; p21waf与caspase-7正相关. 其结果提示人胃癌中Survivin的作用机制可能与其他肿瘤一致, 主要通过与caspase-7以及p21waf的结合, 实现抑制细胞凋亡功能. 为证实这一推测, 本研究选用了胃癌细胞系SGC7901作为研究模型. SGC7901是1981年建立的一株胃癌淋巴结转移癌细胞系, 该细胞系具有凋亡率低而Survivin表达高的特点[25], 是良好的符合本研究的体外模型.

通过使用不同浓度的Survivin ASON直接抑制Survivin的表达时, 我们发现Survivin表达出现明显抑制, 但是caspase-7以及p21waf表达并无明显变化. 印证了Survivin并非通过调控caspase-7以及p21waf的表达实现抑制细胞凋亡功能的理论推测.

通过IFN-γ刺激SGC7901细胞时, caspase-7以及p21waf表达上升, 同时, Survivin的表达明显下降. 结合前期研究[22], 该现象提示胃癌中, IFN-γ可抑制Survivin的表达, 同时促进caspase-7以及p21waf表达, 通过调控多条途径发挥其生物学作用, 其下游途径间调节机制及意义有待进一步研究.

在本研究中, IFN-γ作用于胃癌SGC7901细胞, 其细胞凋亡水平无明显变化, 该结果与Reed等研究结果一致[25]. 而当Survivin ASON抑制Survivin表达时, 细胞凋亡水平也无明显变化, 该结果与胃癌细胞系HS-746T和MKN-45中的实验结果不一致[17,18], 我们认为可能与本研究使用的Survivin ASON浓度有关, 并提示SGC7901细胞中可能存在多条凋亡抑制的途径.

评论
背景资料

Survivin是迄今发现作用最强的肿瘤细胞凋亡抑制因子之一. 34.5%胃癌组织不同程度表达Survivin, 且其表达水平与胃癌凋亡指数呈负相关. Survivin可与caspase-7和p21waf等结合抑制细胞凋亡. 干扰素γ(IFN-γ)是Ⅱ型干扰素中的唯一成员, 可通过上调p21waf和caspase-7的表达而促进细胞凋亡.

同行评议者

纪小龙, 教授, 武警总医院纳米医学研究所

相关报道

近期的研究发现: 分别向胃癌细胞系HS-746T和MKN-45中导入Survivin反义寡核苷酸, 胃癌细胞凋亡均明显增强.

应用要点

本研究证实IFN-γ对Survivin通路存在调控作用. 该结论可望进一步完善当前凋亡调控理论, 并为临床治疗提供新的角度和思考.

同行评价

本文选题恰当, 对于治疗胃癌有一定的临床参考意义.

编辑: 曹丽鸥 电编:何基才

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