hMLH1及hPMS2 mRNA在胃癌组织中荧光定量RT-PCR的检测及其临床意义

摘要

目的: 探讨DNA错配修复基因hMLH1及hPMS2在胃癌组织中的表达水平及其临床意义.

方法: 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对40例胃癌患者的癌组织、40例癌旁胃炎组织及21例慢性胃炎患者的慢性胃炎组织hMLH1 mRNA及hPMS2 mRNA进行定量检测, 以三磷酸甘油醛脱氢酶基因(hGAPDH)为内参照.

结果: 胃癌组织、癌旁组织、慢性胃炎组织中hMLH1 mRNA的相对含量分别是7.23±11.91, 3.80±5.13, 2.01±1.25, 三组相比差异有统计学意义(F = 3.272, 均P = 0.042), 胃癌组织中hMLH1 mRNA含量明显高于其他两组, 癌旁组织中含量明显高于慢性胃炎组织中的含量(均P<0.05); 各组织中hPMS2 mRNA的相对含量分别是0.43±0.35, 0.55±0.39, 0.32±0.15, 3组相比差异有统计学意义(F = 3.349, 均P = 0.039), 胃癌组织与癌旁组织中hPMS2 mRNA的含量差异无统计学意义, 但均高于慢性胃炎组织中的含量(均P<0.05). 除hMLH1 mRNA含量在有、无淋巴结转移的胃癌组织中有显著差异(均P<0.05)外, 在胃癌组织中hMLH1 mRNA及hPMS2 mRNA相对含量受肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移的影响不大(均P>0.05).

结论: 胃癌组织和癌旁组织与慢性胃炎组织相比存在hMLH1及hPMS2 mRNA转录差异, 这种基因的转录差异可能与胃癌的发生有关, 而与胃癌的发展关系不显著.

关键词: hMLH1 mRNA; hPMS2 mRNA; 胃癌; DNA错配修复基因; 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应

Clinical significance of detection of hMLH1 and hPMS2 mRNA expression in gastric cancer by real-time fluorescent quantitative RT-PCR

Guang-Song Pan, Xi-Shuang Liu, Kun Yang

Guang-Song Pan, Xi-Shuang Liu, Center for Endoscopy, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Kun Yang, Central Laboratory, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Supported by: the Science and Technology Program Foundation of Qingdao, No. 06-2-2-5-nsh-3.

Correspondence to: Xi-Shuang Liu, Center for Endoscopy, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, 16 Jiangsu Road, Qingdao 266003, Shandong Province, China. liuxishuang1@sina.com

Received: April 21, 2010
Revised: June 18, 2010
Accepted: June 28, 2010
Published online: August 28, 2010

Abstract

AIM: To investigate the expression of DNA mismatch repair genes hMLH1/hPMS2 and to analyze their clinical significance in gastric cancer.

METHODS: The expression of hMLH1/hPMS2 mRNAs in 40 specimens of gastric cancer and cancer-adjacent mucosa tissue and 21 specimens of chronic gastritis tissue was detected by real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The human glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (hGAPDH) gene was used for normalization of gene expression levels.

RESULTS: The level of hMLH1 mRNA in gastric cancer was significantly higher than those in cancer-adjacent mucosa tissue and chronic gastritis tissue (7.23 ± 11.91 vs 3.80 ± 5.13 and 2.01 ± 1.25, respectively; both P < 0.05). The level of hMLH1 mRNA was significantly higher in cancer-adjacent mucosa tissue than in chronic gastritis tissue (P < 0.05). The level of hPMS2 mRNA was significantly higher in gastric cancer and cancer-adjacent mucosa tissue than in chronic gastritis tissue (0.43 ± 0.35 and 0.55 ± 0.39 vs 0.32 ± 0.15, respectively; both P < 0.05). No significant difference was noted in the level of hPMS2 mRNA between gastric cancer and cancer-adjacent mucosa tissue. The expression levels of hMLH1/hPMS2 mRNAs in gastric cancer showed no significant correlation with tumor size, infiltration degree, and lymph node metastasis. However, the expression level of hMLH1 mRNA was significantly higher in gastric cancer with lymph node metastasis than in that without lymph node metastasis (all P < 0.05).

CONCLUSION: The expression levels of hMLH1 /hPMS2 gene in gastric cancer and cancer-adjacent mucosa tissue are abnormal when compared with that in chronic gastritis. Abnormal transcription of hMLH1/hPMS2 may be related with the genesis of gastric cancer, but not involved in the progression of the disease.

Key Words: hMLH1 mRNA; hPMS2 mRNA; Gastric cancer; DNA mismatch repair gene; Real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction

0 引言

胃癌是消化系最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率长期居消化系肿瘤之首, 他的发生及发展是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程. 其中错配修复基因(mismatch repair genes, MMR genes)属管家基因, 负责对细胞内错配碱基进行修复, 其中任何一个或多个的变异都会引起DNA错配修复错误致肿瘤易感[1,2]. 本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术检测在人胃癌、癌旁及慢性胃炎组织中hMLH1及hPMS2 mRNA的相对含量水平, 探讨hMLH1及hPMS2基因与胃癌发生、发展的关系, 进一步了解胃癌发生发展的分子机制.

1 材料和方法

1.1 材料

2008-01/2008-06青岛大学医学院附属医院外科手术切除的胃癌组织40例, 男29例, 女11例, 年龄36-79(平均年龄60.5)岁, 术前未经放、化疗. 每例均取相应癌旁组织, 即距离癌组织边缘>5 cm的胃黏膜组织, 其中浅表性胃炎17例, 萎缩性胃炎23例. 胃镜活检21例慢性胃炎组织(每例以活检钳取3块), 其中浅表性胃炎10例, 萎缩性胃炎11例, 男11例, 女10例, 年龄31-76(平均年龄50.19)岁. 将新鲜组织置液氮速冻后存于-70 ℃冰箱备用. 全部病例均经病理检验证实. 引物采用fastPCR设计, hMLH1上游引物为5'-TCTCAGGCCAGCAGAGTGAA-3', 下游引物为5'-TGTGTGAGCGCAAGGCTTTA-3', PCR产物为93 bp; hPMS2上游引物为5'-GCACTGAGCGATGTCACCATT-3', 下游引物为5'-TTCCTTATGGCGCACAGGTAGT-3', PCR产物长度为171 bp; 内参三磷酸甘油醛脱氢酶(hGAPDH)上游引物为5'-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3', 下游引物为5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3', PCR产物长度为146 bp, 均由上海生工生物工程技术有限公司合成. hMLH1的TaqMan荧光探针序列为5'(FAM)-A AACTCCTGGAAGTGGACTGTGGAACACAT(TAMRA)-3', hPMS2的TaqMan荧光探针序列为5'(FAM)-TATCCAGAAAACCCCCTAC CCCCGC(TAMRA)-3', 内参hGAPDH的TaqMan荧光探针序列为5'(FAM)-TCATCAGCAAT GCCTCCTGCACCA(TAMRA)-3'均由宝生物工程(大连)有限公司合成. 总RNA提取及荧光定量RT-PCR试剂购于宝生物工程(大连)有限公司.

1.2 方法

采用TRIzol法提取总RNA. 10 μL逆转录反应体系: 5×PrimeScript^TM Buffer 2 μL, PrimeScript^TM RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL, Oligo dT Primer 0.5 μL, Random 6 mers 0.5 μL, Total RNA 2 μL, RNase Free dH₂O 4.5 μL. 反应条件: 37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, -20 ℃保存备用. 20 μL PCR反应体系: Premix Ex TaqTM 10 μL, PCR Forward Primer(6 μmol/L)0.7 μL, PCR Reverse Primer(6 μmol/L)0.7 μL, 荧光探针溶液0.8 μL, 模板(cDNA溶液)2 μL, dH₂O 5.8 μL. PCR扩增条件: 95 ℃ 10 min预变性; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环. 采用LightCycler Real-Time PCR仪进行反应. 反应结束后, 由LightCycler Real-Time PCR软件自动记录荧光曲线并分析计算出Ct值. 以hGPADH作为内对照, 检测被测样品RNA的完整性和可靠性. 结果的计算: ΔΔCt = (样品Ct均值-内参照Ct均值)-(对照样品Ct均值-对照内参照Ct均值), 然后取2^-ΔΔCt即代表被检样品初始hMLH1及hPMS2 mRNA的含量.

统计学处理 采用SPSS11.5软件处理系统进行统计学分析. hMLH1 mRNA、hPMS2 mRNA的相对含量以mean±SD表示. 统计学方法采用单因素方差分析及t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

胃癌组织、癌旁组织及非胃癌患者的慢性胃炎组织中hMLH1 mRNA、hPMS2 mRNA相对含量见图1, 表1. hMLH1 mRNA含量在胃癌组织中>癌旁组织>非胃癌患者慢性胃炎组织, 两两比较均有统计学意义(t = 2.665, 2.669, 2.005, P = 0.010, 0.009, 0.042), 3组相比有统计学意义(均P<0.05).

表1 不同胃黏膜组织中hMLH1、hPMS2 mRNA相对含量水平 (mean±SD).

分组	n	hMLH1 mRNA	F值	P值	hPMS2 mRNA	F值	P值
胃癌组	40	7.23±11.91	3.272	0.042	0.43±0.35	3.349	0.039
癌旁组	40	3.80±5.13			0.55±0.39
慢性胃炎组	21	2.01±1.25			0.32±0.15

图1 实时荧光扩增曲线.

hPMS2 mRNA含量在胃癌组织与癌旁组织中均高于非胃癌患者慢性胃炎组织, 差异有统计学意义(t = 2.391, 2.555, P = 0.020, 0.013), 但胃癌组织与癌旁组织中hPMS2 mRNA的含量差异无统计学意义(t = 1.497, P = 0.138). 3组相比差异有统计学意义(均P<0.05).

胃癌组织中hMLH1 mRNA含量水平受肿瘤大小、浸润程度影响不大(均P>0.05), 与淋巴结转移有关(P<0.05, 表2); hPMS2 mRNA含量水平受肿瘤大小、浸润程度、有无淋巴结转移影响不大(均P>0.05, 表3).

表2 不同临床参数中胃癌组织hMLH1 mRNA含量水平 (mean±SD).

临床参数	n	hMLH1 mRNA水平	t值	P值
肿瘤大小(cm)
>5	27	8.53±13.76	0.992	0.056
<5	13	4.54±6.25
浸润深度
浆膜外	34	8.27±12.66	1.321	0.053
浆膜内	6	1.36±1.06
淋巴结转移
有	32	8.55±12.99	1.423	0.031
无	8	1.94±1.84

表3 不同临床参数中胃癌组织hPMS2 mRNA含量水平 (mean±SD).

临床参数	n	hMLH2 mRNA水平	t值	P值
肿瘤大小(cm)
>5	27	0.33±0.28	2.730	0.292
<5	13	0.63±0.39
浸润深度
浆膜外	34	0.42±0.37	0.172	0.130
浆膜内	6	0.45±0.20
淋巴结转移
有	32	0.42±0.36	0.182	0.498
无	8	0.45±0.31

3 讨论

DNA错配修复基因是一组保守基因, 具有修复DNA错配、维持基因组稳定降低自发性突变的功能[3,4]. 目前从人体细胞中共分离克隆到9个MMR基因, 其通过编码不同的MMR蛋白, 特异性识别并修复错配碱基, 保持遗传物质的稳定性[5], 并能够诱导受到DNA严重损伤的细胞凋亡[6]. hMLH1是最先发现的错配修复基因之一, 与肿瘤关系密切[7]. hMLH1在执行错配修复功能时与hPMS2构成异源二聚体hMutLα, 具有提高与错配位点结合效率的功能, 对hMutSα具有辅助作用, 同时hPMS2基因也通过介导DNA损伤细胞的凋亡发挥抗肿瘤作用[8-10].

一般认为错配修复基因表达减少会引起错配修复功能下降或缺失, 进而导致DNA复制时产生的错配碱基因得不到修复而发生积累, 最后使细胞发生癌变. 但是一些恶性肿瘤如胶质母细胞瘤、支气管肺泡细胞癌、膀胱癌、子宫内膜癌, 却出现hMLH1或hMSH2表达增加[11-13]. 亦有多项研究证实在胃癌组织中hMLH1启动子区的甲基化导致hMLH1基因失活, 使组织中仅表达少量的hMLH1蛋白[14,15]. 但本研究结果显示, hMLH1 mRNA、hPMS2 mRNA含量在胃癌及癌旁组织中均明显高于非胃癌患者胃炎组织中含量, 提示胃癌及癌旁组织中hMLH1、hPMS2基因转录增加. hMLH1、hPMS2基因在胃癌及癌旁组织中不但没有失活或表达减少, 反而存在过度激活和表达增多的现象. 有学者认为肿瘤细胞过度增殖时会伴有DNA碱基错配增多, 从而引起错配修复蛋白代偿性表达增多[16]. 但错配修复蛋白的高表达是否代表错配修复功能的增强尚不清楚. hMLH1、hPMS2基因过度激活的机制亦可能为: 机体细胞在正常生理状态下, 不存在遗传物质的变异, 所以hMLH1、hPMS2基因处于低转录状态. 细胞在增殖过程中一旦出现遗传物质的错配, hMLH1、hPMS2基因则被激活, 修复错配的基因, 但hMLH1、hPMS2基因可能存在突变产生不全蛋白导致错配基因不能修复[17], 从而形成恶性循环, 导致hMLH1、hPMS2 mRNA含量增加. 有研究指出hMLH1基因在遗传性非息肉性结肠癌(hereditary non-polyposis colon cancer, HNPCC)、胃癌中存在多位点的突变[18-20]. 也有研究提出hPMS2基因在乳腺癌组织中发生移码或点突变, mRNA出现错误, 产生缺陷蛋白最终导致不能修复错配基因, 其研究结果[21]亦支持上述推论. 但胃癌组织中hMLH1、hPMS2基因过度激活的具体机制仍有待进一步研究. 癌旁组织细胞与癌细胞处于同一机体, 有着同样的遗传背景, 受到同样的环境刺激, 有着同样基因突变的积累, 被看做肿瘤易发组织[22,23]. 本研究显示癌旁组织中hMLH1 mRNA、hPMS2 mRNA含量明显高于非胃癌患者的慢性胃炎组织, 更接近甚至高于胃癌组织中含量, 提示hMLH1及hPMS2基因转录异常积累到一定水平后可能诱发组织向癌的演变, 与肿瘤发生密切相关, 但其作用机制尚不明确, 有待于进一步研究. 这可能是胃癌术后残胃癌的发生机制之一, 对胃癌术后患者定期复查残胃组织中hMLH1、hPMS2 mRNA含量, 有望早期发现残胃的癌变, 以便早期进行治疗.

胃癌的发生是一个漫长过程, 一般认为胃癌的发生过程是从正常胃黏膜细胞经内外环境因素作用发展到慢性胃炎进而到胃癌前病变, 包括肠上皮化生、腺瘤和不典型增生, 经过一系列基因突变的积累最终导致胃癌的发生[24]. 本研究中hMLH1 mRNA在慢性胃炎组织、癌旁组织及癌组织中的含量逐渐增加, 亦即随着组织损伤的加重, hMLH1基因转录异常增加, 反映了异常基因的积累促使癌发生进展. hPMS2 mRNA表达情况与hMLH1 mRNA类似, 癌旁组织与癌组织中差异不显著, 但均显著高于非胃癌患者慢性胃炎组织中的含量. hMLH1 mRNA及hPMS2 mRNA受肿瘤组织的直径、浸润程度及淋巴结转移影响不大(均P>0.05), 仅hMLH1 mRNA在有淋巴结转移时表达更高(P<0.05). 提示hPMS2基因转录失调可能只与肿瘤的发生有关, 与肿瘤的发展关系不大; hMLH1基因转录失调不仅与肿瘤的发生相关, 还与淋巴结转移有关. 因此应用实时荧光定量RT-PCR技术对hPMS2 mRNA进行定量检测有望对胃癌的发生起到警示作用. 对hMLH1 mRNA的检测可对胃癌术前患者有无淋巴结转移进行初步评估.

hMLH1基因改变与胃癌发生密切相关, hPMS2基因改变在胃癌发生中的作用亦逐渐受到重视, 但对其机制了解尚不完全明确, 仍需进一步研究, 可对其进行基因测序及蛋白质表达水平测定.

评论

背景资料

DNA错配修复(MMR)基因是生物进化过程中的保守基因, 具有修复DNA错配、增强DNA复制忠实性、维持基因组稳定, 降低自发性突变的功能. MMR发生异常时, 无法修复DNA复制过程中出现的碱基错配, 造成细胞内遗传物质突变率增加, 产生遗传不稳定性, 最终引起细胞恶性转化.

同行评议者

陈卫昌, 教授, 苏州大学附属第一医院消化内科

研发前沿

hMLH1基因改变与胃癌发生密切相关, hPMS2基因改变在胃癌发生中的作用亦逐渐受到重视, 亟待研究探讨其能否成为早期诊断胃癌的确切指标.

创新盘点

本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术对hMLH1及hPMS2 mRNA水平进行检测, 较传统PCR技术更为精确.

同行评价

本文设计合理, 创新性尚可, 有一定的可读性.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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