文献综述 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-08-18; 18(23): 2448-2452
在线出版日期: 2010-08-18. doi: 10.11569/wcjd.v18.i23.2448
内皮素B受体基因甲基化与肿瘤关系的研究进展
吴川清, 陶凯雄
吴川清, 陶凯雄, 华中科技大学同济医学院附属协和医院腔镜外科 湖北省武汉市430022
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30872473.
作者贡献分布: 本综述由吴川清完成; 陶凯雄审校.
通讯作者: 陶凯雄,主任医师, 医学博士, 博士生导师, 430022, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属协和医院腔镜外科. kaixgtao@public.wh.hb.cn
电话: 027-85351619
收稿日期: 2010-05-31
修回日期: 2010-07-07
接受日期: 2010-07-12
在线出版日期: 2010-08-18

遗传学修饰的DNA甲基化在肿瘤的发生发展中起重要作用. 内皮素受体B(endothelin receptor B, EDNRB)基因是候选的抑癌基因之一. 甲基化引起EDNRB基因失活与某些肿瘤发生的关系日益受到人们的关注, 可能成为某些肿瘤早期诊断的分子标志物, 同时由于DNA甲基化具有可逆性, 也可为某些肿瘤提供新的治疗靶点.

关键词: 内皮素受体B; 基因; 高甲基化; 肿瘤
引文著录: 吴川清, 陶凯雄. 内皮素B受体基因甲基化与肿瘤关系的研究进展. 世界华人消化杂志 2010; 18(23): 2448-2452
Advances in understanding the relationship between aberrant methylation of EDNRB and tumors
Chuan-Qing Wu, Kai-Xiong Tao
Chuan-Qing Wu, Kai-Xiong Tao, Department of Laparoscopic Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30872473.
Correspondence to: Kai-Xiong Tao, Department of Laparoscopic Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China. kaixgtao@public.wh.hb.cn
Received: May 31, 2010
Revised: July 7, 2010
Accepted: July 12, 2010
Published online: August 18, 2010

DNA methylation is a major epigenetic mechanism and plays an important role in the pathogenesis of tumors. The endothelin receptor B (EDNRB) gene is an important candidate tumor suppressor gene. EDNRB promoter hypermethylation has been detected in several types of tumors and may therefore be used as a useful molecular marker for tumor diagnosis. In addition, EDNRB gene methylation may also be used as a new target for tumor treatment due to the reversibility of DNA methylation.

Key Words: Endothelin receptor B; Gene; Hypermethylation; Tumor
0 引言

抑癌基因启动子高度甲基化被认为是除突变和缺失以外的抑癌基因功能失活的关键机制, 在肿瘤的发生和发展中起重要作用[1]. 候选抑癌基因-内皮素受体B(endothelin receptor B, EDNRB)基因, 已成为目前肿瘤表遗传学研究的热点之一.

1 DNA甲基化与癌症的关系

随着表遗传学的发展, 人们认识到肿瘤不仅是遗传性疾病, 同时也是由DNA甲基化异常引起的基因调控失常的表遗传性疾病[2]. 人类基因组DNA存在广泛的甲基化修饰. 在早期发育阶段, 甲基化和去甲基化的交替进行是细胞得以生长和分化的关键程序, 且在细胞正常发育以及保持基因组稳定性中起着至关重要的作用. 正常细胞内, 启动子区的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛呈非甲基化状态, 而大部分散在分布的CpG岛二核苷酸多发生甲基化[3]. 肿瘤中常伴随基因组整体甲基化水平降低和某些基因CpG岛区域甲基化水平异常升高(如抑癌基因), 并且这两种变化可在一种肿瘤中同时发生. 基因组整体甲基化水平降低可导致原癌基因活化等, 这些因素促进了肿瘤的发生; 基因启动子区的CpG岛发生异常高甲基化可导致基因转录沉默, 使重要基因如抑癌基因等表达极度降低或不表达, 进而也促进了肿瘤细胞的形成[4].

2 EDNRB基因的结构与生物学活性

EDNRB基因位于13号染色体q22, GenBank ID 1910, 长度大约为24 kb, 含7个外显子和6个内含子, 其启动子部位包含一个CpG岛[5], 而在CpG岛的过甲基化作用时基因转录灭活. 其编码产物EDNRB属于G蛋白偶联受体超家族, 与配体内皮素(endothelin, ET)结合传递细胞外的信号, 在胚胎发育过程中, EDNRB/ET-3在神经嵴细胞迁移发育分化成神经节细胞时候扮演着重要角色[6], 与巨结肠病相关联[7]. 目前研究表明: ET-1及其受体(ETAR和ETBR), 通常被称为ET轴(ET-axis), 已经表明与多种人肿瘤的增殖、血管生成和转移有关. 在多种肿瘤中, ET-1表达常增多, 而相应的受体却因肿瘤细胞类型不同而不同[8]. EDNRB基因启动子的高甲基化与多种肿瘤相关联, 伴随有EDNRB基因表达的沉默[9-18].

3 EDNRB基因甲基化在某些人类肿瘤中的发现
3.1 前列腺癌

Pao等[9]发现, 与相应的正常邻近组织相比, 前列腺癌组织中EDNRB基因启动子5'端CpG岛甲基化程度的高低与EDNRB基因表达呈现密切的负相关, 甲基化程度越高则表达越低. 用5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理前列腺癌细胞后, EDNRB基因表达被重新激活. Bastian等[10]研究发现前列腺癌中高甲基化率为14%, 而良性前列腺增生则无甲基化, 其CpG岛高甲基化对前列腺癌有预后价值.

3.2 肝癌

Hsu等[11]以EDNRB和p16两个候选肿瘤抑制基因研究34例肝细胞癌的表遗传学变化发现, EDNRB与p16基因高甲基化的分别为29.4%(10/34)和32.3%(11/34), mRNA转录子的降低与EDNRB与p16基因高甲基化具有明显的相关性. 同时发现EDNRB基因启动子异常甲基化与患者的年龄、性别、临床分期或者是否为病毒感染所致无关联.

3.3 肺癌

Chen等[12]在对79例肺癌的研究中发现, 其中26例(32.9%)有EDNRB基因存在异常甲基化. EDNRB基因启动子高甲基化有组织类型差异, 与临床病理特征无关. mRNA转录子降低与异常甲基化相关. 5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后, H1355人肺癌细胞株的甲基化状态得到逆转, 而且EDNRB基因再次表达.

3.4 食管癌

Zhao等[13]在对21例食管原发鳞状细胞癌和匹配邻近正常组织的研究中发现, 其中5例(23.8%)EDNRB基因5'CpG岛高甲基化, 另外16例(76.2%)肿瘤组织中有相对于低或中等水平的异常甲基化, 肿瘤组织的异常甲基化水平明显高于匹配的邻近正常组织. 通过实时定量PCR分析, 相对于匹配的邻近正常组织, EDNRB基因mRNA的表达在启动子高甲基化的肿瘤组织中明显减少. 在食管鳞状细胞癌株中加入5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后, EDNRB基因表达恢复. 这些说明EDNRB基因启动子高甲基化, 可能在食管鳞状细胞癌的发生中起重要作用.

3.5 白血病

Hsiao等[14]在26例白血病患者和8例随机正常志愿者的研究中, 检测p16和EDNRB基因启动子的高甲基化情况发现: p16在急性淋巴细胞白血病为85%, 在急性粒细胞白血病中为83%, 而慢性粒细胞白血病没有检测到甲基化; EDNRB在急性淋巴细胞白血病中为92%, 在急性粒细胞白血病中为75%, 慢性粒细胞白血病中为100%. 8例随机正常供血者中p16和EDNRB基因启动子没有检测到异常甲基化.

3.6 恶性黑色素瘤

Kumasaka等[15]通过转基因小鼠建立黑色素瘤模型的4种阶段: 非肿瘤、良性、癌前病变及恶性. 通过检测EDNRB基因的表达发现, 随着恶性度的增加, EDNRB基因的表达逐渐减少. 在EDNRB基因为杂合子的转基因模型小鼠(Ednrb+/-; RET mice)中, >80%的模型小鼠的原发肿瘤为恶性, 肿瘤的发生之前没有良性病变部位, 这和人类原发恶性黑色素瘤的形成类似, 也说明了EDNRB基因的表达减少可能促使人恶性黑色素瘤的发生.

3.7 鼻咽癌

Zhou等[16]在对鼻咽癌EDNRB基因的表遗传学的研究中, 通过半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR对49例鼻咽癌患者和12例慢性鼻咽炎活检组织的EDNRB的mRNA表达进行检测; 采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)方法, 测定EDNRB基因的甲基化状态; 4种鼻咽癌细胞株经过5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后检测mRNA表达情况发现: 在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞株中, EDNRB基因表达下调; 而EDNRB甲基化状态, 相对于慢性鼻咽炎组织的42%, 鼻咽癌活检组织高达84%. 5-氮杂-2'-脱氧胞苷的处理均激活了鼻咽癌细胞株EDNRB基因的表达. 从而认为高甲基化影响了EDNRB基因的表达, 可能在鼻咽癌的形成中发挥作用.

3.8 膀胱癌

Yates等[17]取90例恶性膀胱癌和30例正常尿道上皮的样本, 通过定量甲基化特异性PCR对这些样本的17个基因的启动子进行检测发现: EDNRB, RASSF1a, E-cadherin TNFSR25及APC这5种基因与膀胱癌的进展相关. 多变量分析提示: 相对于肿瘤的分级, 这些基因的甲基化程度与肿瘤的进展甚至死亡率更有相关性, 其中EDNRB基因启动子高甲基化对膀胱癌预后敏感度达66%-100%.

3.9 子宫内膜癌

Zhu等[18]进行了子宫内膜癌组织中EDNRB基因启动子区域CpG岛甲基化状态的研究, 取35例子宫内膜癌组织标本和20例正常子宫内膜组织标本作对照. 35例子宫内膜癌组织中, 甲基化率为31.4%(11/35), 13例癌旁组织中的甲基化率为53.9%(7/13), 22例外周血白细胞DNA中的甲基化率为40.9%(9/22), 不同的组织中EDNRB基因启动子的甲基化率比较差异无统计学意义. 但与正常对照组的子宫内膜组织中未检测到该基因启动子的甲基化相比, 差异有统计学意义.

4 EDNRB基因可能成为癌症早期诊断的分子标志物

Zhu等[19]在子宫内膜癌的研究中发现有13例患者仅在癌旁组织或外周血中出现EDNRB基因甲基化, 而癌组织中未出现EDNRB基因的甲基化. 可能是在癌前病变向癌的演进过程中, 继发有其他的分子水平的改变, 如点突变和(或)杂合性缺失, 故能在癌旁组织或白细胞中检出该基因的甲基化. 因此, 甲基化是抑癌基因失活的"二次打击"中其中的"一次打击"[20], 这说明EDNRB基因异常甲基化是癌变过程中的一个早期、频发事件. EDNRB基因启动子异常高甲基化与多种肿瘤的发生相关. EDNRB基因启动子区甲基化状况可能会成为一种非常有前途的分子标志物. 然而EDNRB基因并没有在所有上述肿瘤组织中完全甲基化, 如表1. 这说明肿瘤组织往往存在多基因多位点的甲基化, Phé等[22]研究发现通过多种抑癌基因甲基化的检测对前列腺癌的诊断要比单基因的诊断准确. Chen等[12]在肺癌甲基化与非甲基化的病例中, 5年的生存率无明显差异, 认为EDNRB基因异常甲基化可能不是肺癌唯一的预后因素. 因此发展和采用高通量的基因甲基化检测方法, 鉴定肿瘤特异的基因甲基化图谱将成为这个领域的研究趋势, 而EDNRB基因甲基化的研究必将是甲基化图谱绘制中的重要部分.

表1 EDNRB基因启动子高甲基化情况 (%).
肿瘤甲基化频率
参考文献
肿瘤组对照组
前列腺癌14.00.0[10]
肝癌29.40.0[11]
肺癌32.90.0[12]
食管癌23.80.0[13]
鼻咽癌84.042.0[16]
膀胱癌66-100[17]
子宫内膜癌31.40.0[18]
肾癌73.049.0[21]
5 EDNRB基因CpG岛甲基化主要的检测方法
5.1 MSP

MSP是目前DNA甲基化研究领域最常使用的技术[23]. 其原理: 设计的引物中包含多个CpG位点, 一对引物是针对发生甲基化的CpG位点, 另一对引物是针对未发生甲基化的CpG位点. 检测MSP扩增产物, 若用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段, 则说明该检测的位点存在甲基化; 若用针对处理后非甲基化DNA链的引物扩增出片段, 则说明被检测的位点不存在甲基化. MSP是一种分析给定DNA序列是否存在甲基化的快速定性方法, 但由于甲基化特异引物所包含的CpG位点有限, 会丢失一些甲基化信息.

5.2 亚硫酸盐-基因组测序法

Frommer等[24]利用亚硫酸氢盐对DNA进行化学修饰的方法为DNA甲基化研究开辟了一条全新的思路, 其原理: 单链DNA中未发生甲基化的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐脱氨基而转变为尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变. 然后, 利用PCR技术对需要的那段序列进行扩增, 将尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶, 对PCR产物进行测序并与未经修饰的序列比较, 便可判断该CpG位点是否发生甲基化. 在该技术的推动下, 有关特定基因控制区CpG岛异常甲基化与肿瘤发生相关的报道大量出现, 但是此方法需要大量的克隆测序, 较为繁琐、昂贵.

5.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

Sequenom's EpiTYPER是近年来问世的一种新型高通量检测甲基化仪器, 这种检测方法是基于碱基特异性裂解结合质谱测定分析建立的新型检测技术, 其原理: 基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后使非甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶(C-U)而甲基化的胞嘧啶保持不变, 然后使用T7-启动子区标记PCR对其进行扩增, 接着使用RNA酶A对产生的单链RNA分子进行碱基特异性裂解. 由于C/T的转变导致反转录链C/A的转变, 结果使含有甲基化CpG位点的片段与含有非甲基化CpG位点的片段的每个CpG位点之间相差16 Da, 这个质量差通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionisation, time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)来分析[25-27], 进而得知基因的甲基化状况. 这种方法适用于大样本基因启动子区CpG位点的甲基化定量检测, 但是相关耗材价格昂贵.

6 肿瘤治疗的新途径

DNA甲基化是靠DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)来维持的, 在CpG甲基化异常机制参与的肿瘤细胞中常表现为过度表达[28]. 而甲基化改变不像基因突变和缺失等改变, 具有可逆性[29]. DNA甲基化的可逆性特征为临床抗肿瘤治疗提供了一种新途径: 应用DNMT抑制剂可以使一些重要基因发生去甲基化, 恢复正常功能. 从广义上讲, DNMT抑制剂可分为3大类: 核苷类DNMT抑制剂, 如5-旦胞苷及其脱氧核糖类似物; 非核苷类DNMT抑制剂, 如肼屈嗪; 自行设计的抑制剂, 如RG108[30]. 5-氮杂-2'-脱氧胞苷是第一个被美国FDA批准上市治疗恶性肿瘤的去甲基化药物, 最初被认为是细胞毒性物质, 后经临床试验研究表明, 它能与DNMT共价结合, 降低酶的生物活性而得以抵制甲基化, 低甲基化后的基因再次活化[31-33]. 有研究显示, 在前列腺癌、鼻咽癌、肺癌和食管癌细胞株中经5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后EDNRB基因重新表达[9,12,13,16]. 目前, 5-氮杂-2'-脱氧胞苷已成功应用于临床的一些实例, 如在急性粒细胞白血病中的应用[34]. 小分子干扰RNA是一种新发现的分子通过与mRNA结合导致其降解和基因沉默. 通过干扰DNMT mRNA, 使DNMT的表达下降, 从而使得DNA去甲基化[35]. 反义寡聚核苷酸是为杂交选择mRNA区域而合成的核苷酸. 如MG98就是一种反义寡聚脱氧胸苷酸, 能够特异地抑制DNMT1 mRNA翻译的过程. 有药物动力学的研究证明, 它的药效与药物剂量无关[36]. DNMT的反义寡聚核苷酸在可以不改变DNA甲基化模式的基础上增加抑癌基因的表达, 提示有可能DNMT调节基因表达是一个不依赖甲基化的过程[37].

7 结论

表遗传学改变已经成为肿瘤研究领域中的热点, EDNRB基因甲基化的异常与上述肿瘤的发生具有一致性, 但因果关系尚不明确. 还有很多问题需要去探索: 导致EDNRB基因异常甲基化的原因是什么? 是否有更多类型的肿瘤发生EDNRB基因异常甲基化? 是否有一种更为特异、简便与价廉的检测方法用以检测EDNRB基因是否在肿瘤性疾病中发生异常甲基化? 有无不良反应更少的药物或其他方法来防止EDNRB基因发生异常甲基化或逆转甲基化? 总之, EDNRB基因与肿瘤关系的研究尚处于初步探索阶段. 相信随着上述问题的逐一解决, 人类对肿瘤的诊断与治疗会迈出一大步.

评论
背景资料

EDNRB基因是一种内皮素受体基因, 作为一种抑癌抑制基因, 其启动子高甲基化在多种肿瘤的发生发展中有着重要作用. 随着检测方法的不断更新, EDNRB基因可能成为某些肿瘤的标志物, 而且甲基化改变不像基因突变和缺失等改变, 具有可逆性. DNA甲基化的可逆性特征为临床抗肿瘤治疗提供了一种新途径, 应用DNA甲基转移酶抑制剂可以使一些重要基因发生去甲基化, 恢复正常功能.

同行评议者

李淑德, 主任医师, 中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科

研发前沿

甲基化引起EDNRB基因失活与肿瘤发生的关系日益受到人们的关注. 在目前报道的基础上, 是否有更多肿瘤的发生与EDNRB基因的甲基化有关, EDNRB基因是否会成为肿瘤筛查的一个广谱分子标志物, 受到了研究者的关注.

相关报道

Phé等研究发现通过多种抑癌基因甲基化的检测对前列腺癌的诊断要比单基因的诊断准确.

创新盘点

本文首次总结了EDNRB基因启动子高甲基化与多种肿瘤发生的关系.

同行评价

本文行文流畅、规范, 参考文献较新, 对阐明肿瘤发生的分子机制和肿瘤的分子靶向治疗的研究, 具有重要的理论指导意义.

编辑:曹丽鸥 电编:吴鹏朕

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