硫化氢对MDA及GSH在大鼠肝星状细胞氧应激中表达的影响

摘要

目的: 探讨硫化氢对MDA与GSH在大鼠肝星状细胞氧应激中表达的影响.

方法: 将HSC-T6分为8组: 空白组(B组, HSC-T6)、对照组(C组, B组+500 μmol/L Fe-NTA)、NaHS组(N1: C组+20 μmol/L NaHS; N2: C组+100 μmol/L NaHS; N3: C组+200 μmol/L NaHS)、格列苯脲组(G1: C组+20 μmol/LGLBN; G2: C组+200 μmol/L GLBN; G3: C组+700 μmol/L GLBN). 用MDA试剂盒测试血清MDA含量; 用GSH试剂盒测定上清中GSH含量. 

结果: 24 h后MDA含量对照组和空白组有明显差异(P<0.05), 而GSH含量12与24 h均有明显差异(均P<0.05). 给予NaHS后, MDA含量24 h N2和N3组与对照组均有明显差异(4.48± 0.07 nmol/mg prot, 3.58±0.02 nmol/mg prot vs 5.05±0.07 nmol/mg prot, 均P<0.05), 12与24 h GSH含量N2和N3组与对照组有明显差异(35.57±2.02 mg/g prot, 36.92±2.30 mg/g prot vs 33.64±2.95 mg/g prot; 36.49±2.08 mg/g prot, 37.59±2.03 mg/g prot vs 31.06±3.08 mg/g prot, 均P<0.05). 给予GLBN处理后, 各项指标结果与给予NaHS处理后结果相对应, 各组与相对应组比较均有明显差异(均P<0.05).

结论: 氧应激下硫化氢对HSC细胞具有保护作用, 可抑制肝纤维化的发生发展.

关键词: 肝星状细胞; 硫化氢; 硫氢化钠; 谷胱甘肽

Effects of hydrogen sulfide on the expression of glutathione and malondialdehyde in culture supernatant of rat hepatic stellate cells during oxidative stress

Cai-Rang Yangdan, Yong Deng, Li Ren, Cong Wang, Hai-Ning Fan

Cai-Rang Yangdan, Yong Deng, Li Ren, Cong Wang, Hai-Ning Fan, Department of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery, the Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810001, Qinghai Province, China

Supported by: National Nature Science Foundation of China, No. 30960374.

Correspondence to: Professor Hai-Ning Fan, Department of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery, the Affiliated Hospital of Qinghai University, 29 Tongren Road, Chengxi District, Xining 810001, Qinghai Province, China. fanhaining@medmail.com.cn

Received: January 7, 2009
Revised: November 20, 2009
Accepted: November 23, 2009
Published online: December 28, 2009

Abstract

AIM: To investigate the effects of hydrogen sulfide (H₂S) on the contents of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in culture supernatant of rat hepatic stellate cell (HSC) during oxidative stress.

METHODS: HSC-T6 cells were divided into four groups: normal control group (untreated cells), ferric nitrilotriacetate (Fe-NTA) treatment group (treated with 500 μmol/L of Fe-NTA), sodium hydrosulphide (NaHS) treatment group (treated with 500 μmol/L of Fe-NTA and NaHS at a concentration of 20, 100 or 200 μmol/L), and glibenclamide (GLBN) treatment group (treated with 500 μmol/L of Fe-NTA and GLBN at a concentration of 20, 200 or 700 μmol/L). The contents of MDA and GSH in culture supernatant of HSC-T6 cells were detected using the MDA kit and GSH kit, respectively.

RESULTS: After HSC-T6 cells were incubated with Fe-NTA for 24 h, the content of MDA in culture supernatant increased significantly (P < 0.05), while the content of GSH in culture supernatant was reduced significantly in cells incubated with Fe-NTA (both P < 0.05). Compared with Fe-NTA-treated cells, the contents of MDA in culture supernatant of cells treated with both Fe-NTA and NaHS for 24 h were reduced significantly (100 μmol/L: 4.48 ± 0.07 nmol/mg prot vs 5.05 ± 0.07; 200 μmol/L: 3.58 ± 0.02 nmol/mg prot vs 5.05 ± 0.07 nmol/mg prot; both P < 0.05), and the contents of GSH in supernatant of cells treated with both Fe-NTA and NaHS for 12 and 24 h increased significantly (100 μmol/L: 35.57 ± 2.02 mg/g prot vs 33.64 ± 2.95 mg/g prot; 36.49 ± 2.08 mg/g prot vs 31.06 ± 3.08 mg/g prot; 200 μmol/L: 36.92 ± 2.30 mg/g prot vs 33.64 ± 2.95 mg/g prot; 37.59 ± 2.03 mg/g prot vs 31.06 ± 3.08 mg/g prot; all P < 0.05). In contrast, GLBN treatment induced opposite effects on the contents of MDA and GSH in Fe-NTA-treated cells when compared with NaHS (all P < 0.05).

CONCLUSION: H₂S may be an antioxidant that can exert protective effects on the liver by inhibiting the development and progression of hepatic fibrosis.

Key Words: Hepatic stellate cell; Hydrogen sulfide; Sodium hydrosulfide; Glutathione

0 引言

肝纤维化源于肝脏纤维组织过度沉积, 是肝脏纤维组织增生和分解失衡的结果. 肝纤维化的机制非常复杂. 肝细胞的炎症、坏死、免疫反应、肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化, 脂质过氧化物的大量外溢, TGF-β, PDGF等多种细胞因子, 均参与了这一过程[1-2]. HSC的增生激活是肝纤维化发生的中心环节[3], 各种致纤维化因素最终都会以HSC为靶标, 通过激活HSC使细胞外基质大量形成并沉积导致肝纤维化的发生[4].

氧应激尤其是脂质过氧化产物例如丙二醛(MDA)等在HSC激活早期具有重要意义[5], MDA可促进Ⅰ型胶原mRNA的表达, 提示氧应激与肝纤维化之间存在可能的联系[6-7], 氧化应激和脂质过氧化与肝纤维化形成的关系密切, 氧化和抗氧化损伤的失衡可以促进HSC的增殖, 导致胶原合成增加. MDA是脂质过氧化的重要中间产物, 能够反应氧化损伤程度, MDA的累积可以通过多种途径激活HSC. 还原型谷胱甘肽(GSH)是一种广泛存在于正常细胞中的生理性活性物质, 含有巯基, 可通过巯基与体内的自由基相结合, 是体内最重要的抗氧化物之一[8].

为了研究硫化氢(H₂S)在肝纤维化发生中的地位和作用[9], 我们运用铁超载的方法激活HSC[10-11], 在细胞水平复制氧应激肝纤维化模型, 给予外源性H₂S供体NaHS和H₂S作用的KATP阻滞药物格列苯脲, 通过测定上清中MDA与GSH含量, 探讨H₂S对HSC的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)购自湖南湘雅细胞基因库; 胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品; DMEM(高糖)为美国Gibco产品; MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所; 次氮基乙酸二钠(Na₂NAC)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司; GSH试剂盒购自碧云天生物技术研究所.

1.2 方法

1.2.1 体外细胞培养: 肝星状细胞株(HSC-T6), 用含15%灭活的胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液, 培养置于37 ℃、50 mL/L CO₂培养箱内培养, 每2-3 d传代1次; 取对数生长期的HSC, 2.5 g/L胰酶消化后, 用含150 mL/L胎牛血清的DMEM配成细胞悬液, 接种于96孔或24孔培养板, 密度为5×10⁷/L, 每一组设3个复孔, 每孔加入DMEM培养液100 μL, 至于37 ℃, 50 mL/L CO₂培养箱中培养过夜. 24 h后细胞贴壁良好, 换用2 mL/L胎牛血清的DMEM培养, 使其生长同步化, 再培养24 h后加入Fe-NTA产生氧应激.

1.2.2 实验分组: 将HSC-T6分为8组: 空白组(B组, HSC-T6); 对照组(C组, B组+500 μmol/L Fe-NTA); NaHS组(N1: C组+20 μmol/L NaHS; N2: C组+100 μmol/L NaHS; N3: C组+200 μmol/L NaHS); 格列苯脲组(G1: C组+20 μmol/L GLBN; G2: C组+200 μmol/L GLBN; G3: C组+700 μmol/L GLBN).

1.2.3 测定MDA及GSH含量: 设置6, 12, 24 h 3个时间点, 用MDA试剂盒测试上清液MDA含量, GSH试剂盒检测上清中GSH含量.

统计学处理 计量资料以mean±SD表示, 用SPSS11.5软件进行统计分析. 组间差异用单因素方差分析(One-way ANOVA), 有显著差异者用Student-Newman-Keuls q检验进行两两比较. 检验水准取α = 0.05.

2 结果

2.1 上清液中MDA含量

给予Fe-NTA后, 6 h和12 h, 对照组和空白组差异不明显, 24 h后对照组和空白组有明显差异(P<0.05). 给予NaHS后6 h和12 h处理组与对照组均无明显差异, 24 h N2和N3组与对照组均有明显差异(均P<0.05). 给予GLBN治疗后6 h和24 h的G2, G3组, 12 h的G3组与对照组均有明显差异(均P<0.05). 各处理组随着时间的延长除G1组在6 h, 12 h差异不明显外, 其余各时间组均有差异(均P<0.05, 表1).

表1 上清液中MDA含量 (nmol/mg prot, n = 3, mean±SD).

分组	6 h	12 h	24 h
空白组	1.96±0.11	2.25±0.13	2.36±0.08
对照组	2.14±0.05	2.78±0.04	5.05±0.07a
N1	2.12±0.01	2.74±0.03	4.85±0.16
N2	2.09±0.03	2.61±0.03	4.48±0.07c
N3	2.04±0.08	2.53±0.21	3.58±0.02c
G1	2.39±0.28e	3.09±0.11e	5.24±0.29e
G2	2.55±0.12ce	3.39±0.07e	5.45±0.07ce
G3	2.69±0.07ce	4.93±1.45ce	6.01±0.15ce

^aP<0.05 vs 空白组;

^cP<0.05 vs 对照组;

^eP<0.05 vs NaHS对应各组.

2.2 上清液中GSH含量

给予Fe-NTA后, 6 h对照组和空白组差异不明显, 12 h与24 h对照组和空白组有明显差异(均P<0.05). 给予NaHS后6 h处理组与对照组无明显差异, 12 h与24 h的N2和N3组与对照组均有明显差异(均P<0.05). 给予GLBN治疗后6 h和24 h的G2, G3组, 12 h的G3组与对照组均有明显差异(均P<0.05). 各处理组随着时间的延长除N1与G1组差异不明显外, 其余各时间组均有差异(均P<0.05, 表2).

表2 上清液中GSH含量 (mg/g prot, n = 3, mean±SD).

分组	6 h	12 h	24 h
空白组	34.95±2.60	37.76±3.81	39.21±2.07
对照组	34.73±2.56	33.64±2.95a	31.06±3.08a
N1	34.20±2.45	34.66±1.97	34.85±2.16
N2	34.23±2.36	35.57±2.02c	36.49±2.08c
N3	34.22±1.98	36.92±2.30c	37.59±2.03c
G1	32.38±0.29ce	31.31±2.87e	30.75±2.28e
G2	32.56±0.13ce	29.10±3.10e	25.46±2.08ce
G3	32.68±0.08ce	27.10±3.20ce	26.03±2.16ce

^aP<0.05 vs 空白组;

^cP<0.05 vs 对照组;

^eP<0.05 vs NaHS对应各组.

3 讨论

HSC的活化是肝纤维化发生的中心环节[12], 无论是那一种病因引起的肝纤维化最终都会激活HSC, 通过效应的自我放大导致肝纤维化的发生发展. 因此抑制他的活化以及降低活化后减轻对机体的损伤也是肝纤维化治疗中的重点.

铁沉积既可以直接激活HSC, 又可以通过脂质过氧化反应导致HSC的间接激活. 刘梅 et al应用不同浓度的次氮基三乙酸铁(Fe-NTA)培养大鼠HSC证实铁剂可以引起鼠HSC的增殖, 导致氧化抗氧化失衡[6]. 本实验通过给予Fe-NTA处理HSC-T6也发现了类似的现象, 提示运用铁超载来促进HSC增殖是一种可靠的肝纤维化造模方法.

氧化应激与肝纤维化形成关系密切, 各种因素造成的肝损伤产生了大量的脂质过氧化物, 超出了机体的清除能力, 使其发生脂质过氧化, MDA水平提高, MDA是脂质过氧化的重要终产物之一, 反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度, 铁超载可产生大量的自由基和脂质过氧化物, 导致机体抗氧化损伤的防御机制受损, 不能清除过多的自由基和MDA等脂质过氧化物[10]. 而HSC内MDA累积, 通过不同途径激活HSC, 促进其增殖和合成胶原, 导致肝纤维化的发生, 于洪波 et al用高脂饮食喂饲大鼠也得出了类似结果[13]. GSH含有巯基, 是体内重要的抗氧化物之一, 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的一种三肽. 他在酶的催化下能与过氧化物和自由基相结合, 对抗氧化物的破坏作用[14].

动物实验证实H₂S能够缓解门脉高压的形成[15-16], 对肝硬化大鼠具有一定的保护作用. 本研究通过铁超载的方法复制出肝纤维化模型, 给予升高和降低H₂S两种处理方式, 结果提示H₂S能够在一定范围内减少氧化损伤, 提高抗氧化能力, 对肝纤维化具有一定的保护作用, 也为GSH在临床上用于脂肪肝和肝纤维化的治疗提供了理论和实验依据, 为继续研究其抗纤维化作用打下了理论基础.

评论

背景资料

肝纤维化是继发于各种慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应, 是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程, 肝纤维化的中心环节-肝星状细胞(HSC)活化一直是慢性肝病的研究热点之一. 因此抑制他的活化以及降低活化后减轻对机体的损伤也是肝纤维化治疗中的重点.

同行评议者

张锦生, 教授, 复旦大学上海医学院病理学系

创新盘点

本研究通过铁超载的方法复制出肝纤维化模型, 给予升高和降低H₂S两种处理方式, 并通过测定上清液中MDA与GSH含量来探讨H2S对HSC的影响.

应用要点

本研究提示, H₂S能够在一定范围内减少氧化损伤, 提高抗氧化能力, 对肝纤维化具有一定的保护作用, 也为GSH在临床上用于脂肪肝和肝纤维化的治疗提供了理论和实验依据, 为继续研究其抗纤维化作用打下了理论基础.

同行评价

本文对硫化氢对MDA及GSH在大鼠肝星状细胞氧应激中表达的影响进行了研究, 内容新颖, 结论有一定参考意义.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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