CIK细胞对裸鼠人胃癌移植瘤生长的抑制作用

摘要

目的: 探讨CIK细胞对裸鼠人胃癌移植瘤生长的抑制作用.

方法:  用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞, 给予多种细胞因子(rhIFN-γ、CD3 mcAb、rhlL-2、rhlL-1), 诱导生成CIK细胞. 培养人胃癌细胞株SGC-7901, 接种至40只裸鼠右腋皮下, 10 d后随机分2组, 每组20只, 分别为CIK组和对照组. 连续5 d在接种肿瘤细胞部位处给予CIK细胞和生理盐水注射治疗, 观察CIK细胞对胃癌移植瘤模型的抗肿瘤疗效. 

结果: CIK组胃癌肿块质量和生存期与对照组相比, 均具有显著性差异(1.21±0.34 g vs 2.73±0.45 g, 65.8±6.2 d vs 44.3±4.8 d, 均P<0.01). 裸鼠体内实验表明, CIK细胞能够显著抑制胃癌细胞的生长, 其抑瘤率可达47.6%, 明显高于对照组(P<0.01).

结论:  CIK细胞在裸鼠体内对人胃癌移植瘤有特异性抑瘤作用, 并可以延长裸鼠生存时间.

关键词: 细胞因子杀伤细胞; 胃癌; 裸鼠

Inhibitory effects of cytokine-induced killer cells on the growth of human gastric cancer xenografts in nude mice

Li-Bing Sun, Guang Yang

Li-Bing Sun, Guang Yang, Department of Oncology, the Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215001, Jiangsu Province, China

Supported by: the Foundation of Suzhou Science and Technology Bureau, No. SS0524.

Correspondence to: Guang Yang, Department of Oncology, the Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 16 Baita West Road, Suzhou 215001, Jiangsu Province, China. libingmoma@gmail.com

Received: November 9, 2009
Revised: November 30, 2009
Accepted: December 7, 2009
Published online: December 18, 2009

Abstract

AIM: To investigate the effects of human cytokine-induced killer (CIK) cells on the growth of human gastric cancer xenografts in nude mice.

METHODS: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from healthy volunteers by Ficoll gradient centrifugation. CIK cells were induced by culturing PBMCs in complete medium containing recombinant human interferon-g (rhIFN-γ), anti-CD3 monoclonal antibody (CD3 mcAb), recombinant human interleukin-2 (rhIL-2), and rhIL-1. Balb/c nude mice were subcutaneously inoculated with human gastric cancer SGC-7901 cells in the logarithmic growth phase. Ten days after inoculation, 40 model mice were randomly divided into two groups: those injected with CIK cells for five days (experimental group) and those injected with NaCl solution for the same duration (control group).

RESULTS: Significant differences were noted in the weight of tumor and the survival time of mice between the experimental group and the control group (1.21 ± 0.34 g vs 2.73 ± 0.45 g, and 65.8 ± 6.2 d vs 44.3 ± 4.8 d, respectively; both P < 0.01). The reduced rate of tumor growth was significantly higher in the experimental group (47.6%) than in the control group (P < 0.01).

CONCLUSION: CIK cells have a strong inhibitory effect on the growth of human gastric cancer xenografts in nude mice and can prolong the survival time of tumor-bearing nude mice.

Key Words: Cytokine-induced killer cells; Gastric cancer; Nude Mice

0 引言

胃癌是威胁人类健康和生命的主要恶性肿瘤之一, 在东亚, 南美及中欧胃癌的发病率极高[1]. 最新调查报告显示, 我国目前胃癌的死亡率位列所有恶性肿瘤之首[2]. 临床早期发现胃癌的比例不足15%, 85%为进展期胃癌, 此时癌组织已经浸润达到肌层或浆膜层, 5年生存率仅为20%左右. 尽管治疗手段水平不断提高, 但治疗效果尚不理想[3]. 研究发现细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer, CIK)细胞对肾癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、卵巢癌等有明显的杀伤效应[4-5]. 本研究观察了CIK细胞体外扩增过程中表型特征的变化, 应用裸鼠人胃癌模型研究CIK细胞对裸鼠人胃癌移植瘤生长的抑制作用, 旨在为胃癌的生物治疗提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c裸鼠40只, ♀, 周龄6-8 wk, 体质量15-20 g, 由苏州大学动物实验中心提供, 于无菌恒温、恒湿半屏障系统内饲养, 饮水均经灭菌处理. 人胃癌细胞株SGC-7901购于上海中国科学院细胞库. CD3McAb、rhINF-γ、rhIL-1购于美国PeproTech公司, rhIL-2购于北京四环药业有限公司, 无血清培养基AIM-V购于北京天润善达公司, Ficoll淋巴细胞分离液购于瑞典Amersham Biosciences公司, 鼠抗人CD3/CD56购于美国Coulter公司.

1.2 方法

1.2.1 CIK细胞的分离、培养和鉴定: 将健康献血者抗凝外周血(苏州市中心血站提供)经Ficoll淋巴分离液梯度离心取界面层单个核细胞, PBS洗涤3次后, 将细胞置于无血清培养基中, 调整细胞浓度为1×107/L, 加入rhIFN-γ l000 kU/L, 置于37 ℃、50 mL/L CO2中培养. 24 h后加入CD3McAb 100 µg/L, rhIL-2 500 kU/L, rhIL-1 100 kU/L, 以后每3 d半量换液1次, 补加rhIL-2 500 kU/L. 参照卫生部2003-03颁布的"人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则". 细胞培养到第10天, 取部分细胞进行细菌、霉菌的检测. 培养14 d后, 台盼蓝计数, 收集培养的CIK细胞, 通过流式细胞仪检测其表面标志物.

1.2.2 动物实验: 将40只Balb/c裸鼠右腋皮下接种0.2 mL 1×10⁹/L SGC-7901胃癌细胞后, 再随机分成2组: CIK组和对照组. 10 d后CIK组的每只裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射0.2 mL 1×10¹⁰/L的CIK细胞, 对照组裸鼠注射0.2 mL生理盐水, 连续注射5 d. 14 d后每组随机取12只裸鼠颈椎脱臼处死, 剥离肿瘤块并称质量, 计算抑瘤率, 公式为: 抑瘤率 = (对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%. 各组剩余8只动物观察生存期.

统计学处理 所有数据均使用SPSS11.0软件包进行统计学分析. 计量资料用mean±SD表示. 各组间采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 CIK表型的鉴定

体外将PBMC经rhIFN-γ、CD3McAb、rhlL-2、rhlL-1诱导培养14 d后, 可见细胞成团簇状生长, 经流式细胞仪检测CIK细胞中CD3⁺、CD56⁺双阳性细胞(CD3⁺/CD56⁺)数量随培养时间的延长而增加. 第0天表达CD3⁺/CD56⁺的细胞占0.6%±0.1%, 而经细胞因子刺激的T淋巴细胞第6、10、14天表达CD3+/CD56+的细胞分别占19.4%±3.1%、33.8%±1.7%、40.1%±2.3%(P<0.01).

2.2 干预后14 d各组肿瘤生长情况及抑瘤率

全部实验裸鼠在接种第7天时在接种部位均有肿瘤形成, 直径为0.5-1 cm. 在CIK组, 裸鼠在干预后14 d内肿瘤有所缩小, 对照组所有裸鼠的肿块均增大. 解剖时发现与对照组相比, CIK组的肿瘤块较小且局限, 对照组的肿瘤块大, 且有肿瘤局部浸现象. CIK组和对照组裸鼠胃癌组织湿质量分别为1.21±0.34 g和2.73±0.45 g, 差异具有统计学意义(P<0.01). CIK细胞对胃癌移植瘤生长的抑制作用明显, 抑瘤率可达47.6%(P<0.01).

2.3 裸鼠生存期比较

CIK组动物在接种肿瘤后第60天开始有死亡, 至75 d全部死亡; 对照组动物从接种肿瘤后第41天开始有死亡, 至52 d全部死亡. CIK组和对照组裸鼠生存期分别为65.8±6.2 d和44.3±4.8 d, 差异具有统计学意义(P<0.01).

3 讨论

CIK细胞是人外周血单个核细胞在多种细胞因子的诱导下产生的, 兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤(natural killer, NK)细胞的非MHC限制性杀瘤优点, 被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案, 而成为临床应用的一种理想效应细胞[6]. CIK细胞的效应细胞是CD3+CD8+、CD3⁺CD56⁺ T细胞为主的异质细胞群, 其功能特点: 选择性地杀伤肿瘤细胞、体外增殖快、杀伤活性高、抗瘤谱广、不良反应小[7-9]. CIK细胞对靶细胞的杀伤原理可能有如下几种: (1)对肿瘤细胞的直接杀伤, 主要通过两条途径发挥作用: (经淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)识别结构激活导致胞质毒颗粒依赖性的溶细胞作用; 通过CIK细胞表面的CD3受体激活产生胞质毒性颗粒介导的溶细胞作用. (2)活化后产生的大量炎性细胞因子的抑瘤杀瘤作用. 大量实验证明, 培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子, 能对肿瘤细胞有直接抑制作用, 还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞.

本实验研究发现在细胞培养过程中, 随着培养时间的延长, 细胞体积变大, CD3⁺/CD56⁺细胞的百分含量也明显增加, 第14天表达CD3⁺/CD56⁺的细胞占40.1%±2.3%, 与第0天相比差异具有统计学意义(P<0.01). CD3⁺/CD56⁺为CIK细胞的主要表型, CIK细胞的细胞毒作用主要存在于CD3⁺/CD56⁺细胞中. CD3⁺/CD56⁺这种自身CIK细胞对自身及异基因肿瘤细胞均有杀伤作用, 因此有潜在的临床研究与应用价值. 我们的研究表明, CIK细胞可有效抑制胃癌细胞的生长, 延长裸鼠的生存期, 这表明CIK细胞适用于胃癌的过继免疫治疗, 对胃癌的临床治疗具有重要意义. 在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下, 应用CIK细胞作为胃癌手术、放疗、化疗后的辅助治疗, 可能有一定的临床应用意义.

评论

背景资料

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一, 传统手术根治及放化疗对进展期胃癌的疗效仍不理想. CIK其杀伤肿瘤细胞效应是非MHC限制性的, 具有强大的抗肿瘤活性, 而成为临床应用的一种理想效应细胞. 本文应用裸鼠人胃癌模型研究CIK细胞对裸鼠人胃癌移植瘤生长的抑制作用, 旨在为胃癌的生物治疗提供实验依据.

同行评议者

吕宾, 教授, 浙江中医学院附属医院(浙江省中医院、浙江省东方医院)消化科.

创新盘点

虽然CIK细胞治疗恶性肿瘤具有广阔的前景, 但疗效并没有达到预期的效果, 改善肿瘤治疗的免疫微环境如抑制或调节共刺激信号的水平, 可能是提高CIK治疗恶性肿瘤疗效的一个新策略.

应用要点

文章重点对CIK对胃癌动物模型的抗癌作用进行研究, 可以为临床开展CIK生物治疗提供更多实验依据.

同行评价

CIK细胞在肿瘤中的作用, 近年有大量的文献报道, 其抑制肿瘤细胞生长的作用将可能成为免疫治疗的重要方法, 是肿瘤免疫研究的热点之一. 因此, 该文的选题有重要的意义.

备注

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

参考文献

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