塞来昔布对不表达环氧合酶-2的胃癌细胞生长的影响

摘要

目的: 探讨选择性COX-2抑制剂celecoxib抑制不表达COX-2的胃癌细胞MGC-803生长的机制.

方法:  采用MTT法研究celecoxib对细胞存活率的影响;流式细胞术检测celecoxib处理后细胞DNA含量的变化, 免疫组织化学方法检测Bax及Bcl-2的表达, Elisa法检测VEGF蛋白表达水平, Western blot法检测COX-2及NF-κB蛋白的表达. 

结果: MGC-803中未检测到COX-2的表达;选择性COX-2抑制剂celecoxib呈浓度和时间依赖性抑制MGC-803细胞生长(r = 0.985, P<0.05), 流式细胞仪检测DNA图谱上表现为G₀/G₁期前出现一个代表凋亡细胞的亚G₁峰. Bax及Bcl-2无表达, celecoxib对细胞分泌VEGF(r = 0.928, P<0.01)及NF-κB蛋白均有抑制作用, 并且NF-κB蛋白的表达和celecoxib呈浓度和时间依赖性(r = 1).

结论:  celecoxib可诱导不表达COX-2的胃癌细胞MGC-803凋亡, 可能通过抑制IKKβ-NF-κB信号通路影响MGC-803细胞的凋亡, 而不依赖COX-2途径.

关键词: MGC-803细胞; 环氧化酶-2; 塞来昔布; Bcl-2; Bax; 蛋白免疫印迹法; 核因子-κB

Celecoxib inhibits the growth of gastric cancer cells not expressing COX-2 in vitro

Yun-Feng Wang, Jiang Li, Cheng-Hua Ge, Shi-Wei Wang, Jian-Jun Zhang, Qiang Xia, Ke-Jian Guo

Yun-Feng Wang, Jiang Li, Cheng-Hua Ge, Shi-Wei Wang, Department of General Surgery, the Central Hospital of Yangpu District (Branch Hospital of Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University), Shanghai 200127, China

Jian-Jun Zhang, Qiang Xia, Center for Liver Transplantation, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China

Ke-Jian Guo, Department of Gastro-Entero-Pancreatic Surgery, the First Hospital of China Medical University, Shengyang 110001, Liaoning Province, China

Correspondence to: Yun-Feng Wang, Department of General Surgery, the Central Hospital of Yangpu District (Branch Hospital of Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University), Shanghai 200090, China. wangyunfeng197911 @hotmail.com

Received: October 7, 2009
Revised: November 4, 2009
Accepted: November 9, 2009
Published online: December 18, 2009

Abstract

AIM: To investigate whether celecoxib, a selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, can induce the apoptosis of human gastric cancer MGC-803 cells not expressing COX-2 and explore potential mechanisms involved.

METHODS: Cell proliferation was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Cell cycle distribution was measured by flow cytometry. The expression of Bax and Bcl-2 proteins was detected by immunohistochemistry. The secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein was detected by enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA). The expression of COX-2 and nuclear factor-κB (NF-κB) proteins was examined by Western blot.

RESULTS: The expression of COX-2 protein was not detected in MGC-803 cells. Celecoxib could inhibit the proliferation and induce the apoptosis of MGC-803 cells in a dose- and time-dependent manner. The reduced rates of growth in cells treated with celecoxib at concentrations of 25, 50, 75 and 100 μmol/L for 24 h were 48.4%, 54.9%, 58.69% and 63.80%, respectively. Flow cytometry analysis showed that the apoptotic rate of MGC-803 cells treated with celecoxib was 4%, and a sub-G1 cell peak was present. Celecoxib inhibited the secretion of VEGF protein in MGC-803 cells. With the prolongation of the duration of incubation with celecoxib, the level of secreted VEGF decreased. Celecoxib could also inhibit the secretion of NF-κB protein by inhibiting its expression in a time-dependent manner.

CONCLUSION: Celecoxib inhibits growth and induces apoptosis of MGC-803 cells in a COX-2-independent manner. Celecoxib exerts its antitumor effects possibly by inhibiting the expression of NF-κB protein.

Key Words: MGC-803 cells; Cyclooxygenase-2; Celecoxib; Bcl-2; Bax; Western blot; Nuclear factor-κB

0 引言

大量研究表明, 环氧化酶-2(cyclooxygenas 2, COX-2)抑制剂能有效预防肿瘤发生. 其机制主要是诱导细胞凋亡、调控细胞周期、影响肿瘤新生血管生成等. 这种作用与非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)作用的靶点-前腺素(PG)合成限速酶COX-2有关[2]. 我们的研究发现, 选择性COX-2抑制剂celecoxib(塞来昔布)可诱导不表达COX-2的胃癌细胞MGC-803凋亡. 进一步的研究发现癌细胞与正常组织的COX-2表达并无显著差异, 我们推测celecoxib诱导不表达COX-2的胃癌细胞MGC-803凋亡的作用不是通过COX-2起作用,可能存在其他作用途径. 因此, 本研究拟通过体外的细胞株研究celecoxib是否诱导不表达COX-2的胃癌细胞的凋亡, 试图从另一侧面探讨celecoxib诱导胃癌细胞凋亡的机制.

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基, 小牛血清购自美国Invitrogen公司; MTT, DMSO购自Sigma公司; celecoxib由辉瑞制药有限公司提供; BCA蛋白定量试剂盒购自北京博奥森生物技术公司; 人的 VEGF ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;抗COX-2一抗及抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司; 核转录因子-κB(NF-κB)mAb购自美国Santa Cruz公司; 胰蛋白酶、NF-κB二抗、增强化学发光试剂盒(ECL)购自北京中山公司; 其余试剂均为国产分析纯试剂; 人胃癌细胞系MGC-803购自中科院上海细胞所.

1.2 方法

1.2.1 COX-2在胃癌细胞株中表达的检测: 采用免疫印迹实验(Western blot)检测COX-2在胃癌细胞株中的表达. 取对数生长期细胞(约109-1010 cells/L), 用冰PBS液洗涤2次, 加入裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 0.2 g/L NaN3, 1 g/L SDS, 1.0 mmol/L PMSF, 0.2 g/L aprotinin, 1.0 g/L NP40, 5.0 g/L脱氧胆酸钠, pH8.0)混匀, 冰浴30 min. 收集细胞裂解液4 ℃, 12 000 g离心5 min, 吸取上清, BCA法蛋白定量后, 调整蛋白量进行SDS-PAGE电泳并将蛋白转移到PVDF膜上. 用PBST洗膜3次, 每次5 min. 室温下用含50 g/L脱脂奶粉(PBST溶解)封闭PVDF膜1 h或过夜. 随后加入适当稀释的一抗(抗COX-2抗体, 美国Santa Cruz公司; β-actin抗体, NewMarker公司)室温温育1 h. 用PBST洗脱3次后加入相应的适当稀释的二抗(抗兔二抗, 美国Santa Cruz公司), 温育1 h. PBST洗脱3次后曝光、显影, 凝胶成像系统扫描分析结果.

1.2.2 celecoxib对胃癌细胞生长的影响: (1)细胞存活率测定(MTT法): 收集对数期生长的MGC-803细胞, 调整细胞悬液浓度, 分于96孔板, 每孔100 μL, 5000-6000个/孔. 置37 ℃、50 mL/L CO₂温箱培养使细胞贴壁, 培养24 h. 加入两种不同浓度药物样品各200 μL(50和100 μmol/L, 溶剂为含175 mL/L乙醇的RPMI 1640), 分别继续培养至12、24、48、72 h. 小心吸去上清, 加入80 μL新鲜RPMI 1640培养液, 于结束前4 h加入20 μL MTT溶液(5 g/L). 然后吸掉上清, 每孔加入150 μL二甲基亚砜, 置摇床上低速振荡10 min, 使结晶物充分溶解. 在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值. 同时设置空白孔(含175 mL/L乙醇的RPMI 1640、MTT、二甲基亚砜), 对照孔(细胞、含175 mL/L乙醇的RPMI 1640、MTT、二甲基亚砜), 每组设定3复孔. 计算抑制率 = [(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100%. (2)流式细胞仪分析: 取50 μmol/L celecoxib与胃癌细胞作用24 h后的细胞(1×10⁹ cells/L), 用PBS洗涤2次, 离心后以4 ℃的700 mL/L乙醇固定过夜. 测定前离心洗去乙醇, 加碘化丙啶染液(含50 mg/L PI, 10 mg/L RNase A)避光染色30 min. 以流式细胞仪进样测定.

1.2.3 Bax、Bcl-2免疫组织化学染色: 取50 μmol/L celecoxib作用48 h后的对数生长期细胞进行免疫组织化学染色, 同时用PBS代替一抗作为阴性对照, 用已知的阳性反应组织作阳性对照. 结果判定标准: 凡细胞质中出现明显的棕黄色颗粒为Bcl-2、Bax蛋白阳性细胞. 每片观察5个高倍视野, 不少于500个细胞, 肿瘤细胞染色阳性率在0%记0分, 1%-5%记l分, 5%-30%记2分, 30%-60%记分, >60%记为4分.

1.2.4 NF-κB蛋白在胃癌细胞株中表达的检测: 取celecoxib(50及100 μmol/L)作用24及48 h的对数生长期的细胞用PBS洗涤2次, 加入裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 0.2 g/L aprotinin, 1.0 g/L NP40, 5.0 g/L脱氧胆酸纳)混匀, 冰浴30 min. 收集细胞裂解液4 ℃, 离心5 min, 吸取上清, BCA法蛋白定量后, 调整蛋白量为35 μg进行SDS-PAGE电泳. 并将蛋白转移到PVDF膜上. 用PBST洗膜3次, 每次5 min. 室温下用含50 g/L脱脂奶粉(PBST溶解)封闭PVDF膜1 h或过夜. 随后加入适当稀释的一抗(抗NF-κB抗体, 碧云天生物技术研究所; β-actin抗体, New Marker公司)室温温育1 h. 用PBST洗脱3次后加入相应的适当稀释的二抗(抗兔二抗, 碧云天生物技术研究所), 温育1 h. PBST洗脱3次后曝光、显影,凝胶成像系统扫描分析结果.

1.2.5 VEGF蛋白表达的检测: 按Elisa试剂盒建立VEGF蛋白标准曲线, 取对数生长期的细胞, 按1×109 cells/L的浓度, 每孔500 μL培养基分别加入到48孔板中, 24 h细胞贴壁后分别加药(50 μmol/L celecoxib): 细胞对照组、celecoxib(50 μmol/L)处理组, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 h后收集上层培养基, 每个时间设3个, 离心后上清转入tube管中备用, 将备好的培养基加入已平衡至室温板条的相应孔中(每孔100 μL). 37 ℃孵箱孵育120 min, 取出板充分洗涤5次, 向滤纸上印干后每孔加入一抗工作液50 μL, 充分混匀, 37 ℃孵箱孵育60 min, 洗板5次, 干后每孔加入酶标抗体工作液100 μL, 37 ℃孵箱孵育60 min, 洗板5次, 加入底物工作液每孔100 μL, 37 ℃孵箱暗处反应10 min, 每孔加入终止液1滴, 混匀后即刻测量A_492nm值, 减去空白孔A值, 得各标本的A值.

统计学处理 实验数据以mean±SD表示, 采用组间t检验进行统计学处理, 及应用SPSS13统计软件进行方差分析及直线回归与相关性的分析.

2 结果

2.1 胃癌细胞MGC-803中COX-2的表达

免疫印迹实验(Western blot)结果显示, 在MGC-803胃癌细胞中未检到COX-2表达.

2.2 celecoxib对胃癌细胞株MGC-803生长的影响

采用MTT法检测发现不同浓度celecoxib处理MGC-803细胞不同时间后, MGC-803细胞的存活率随celecoxib剂量增加和时间延长而降低(图1). 在药物与细胞孵育12 h时, 已有大量细胞发生凋亡现象. 对照组的不同时间的A值之间无差异(P>0.05), 说明细胞正常生长无影响. 不同剂量组之间的A值有差异(P<0.05), 不同时间A值之间也有差异(P<0.05, 表1). 抑制率和celecoxib的作用时间及剂量有直线相关关系, 呈正相关关系(r = 0.985, P<0.05, 表2).

表1 celecoxib作用MGC-803细胞的A值 (mean±SD).

分组	12 h	24 h	48 h	72 h
对照组	1.033±0.079	1.032±0.079	1.086±0.159	1.086±0.159
空白组	0.220±0.003	0.202±0.008	0.165±0.008	0.161±0.004
celecoxib(μmol/L)
25	0.707±0.009	0.631±0.007	0.526±0.006	0.419±0.013
50	0.689±0.011	0.577±0.009	0.449±0.001	0.327±0.003
75	0.669±0.003	0.546±0.007	0.393±0.002	0.257±0.009
100	0.639±0.009	0.503±0.009	0.342±0.007	0.206±0.006

图1 不同实验组细胞生长抑制率与作用时间的关系.

表2 celecoxib作用后MGC-803细胞的抑制率 (%, mean±SD).

	12 h	24 h	48 h	72 h
25 μmol/L	40.25±1.04	48.40±1.09	60.87±1.07	72.12±1.12
50 μmol/L	42.42±1.12	54.90±1.10	69.20±1.11	82.10±1.62
75 μmol/L	44.84±1.08	58.69±1.03	75.26±1.06	89.74±2.08
100 μmol/L	47.79±1.18	63.80±1.11	80.80±1.15	95.20±2.41

2.3 流式细胞检测结果

celecoxib能够诱导MGC-803细胞发生凋亡, DNA图谱上表现为G₀/G₁期前出现一个代表凋亡细胞的亚G₁峰. 同正常细胞对比可见G₀/G₁期细胞比例逐渐增加, S期和G₂/M期细胞比例降低(图2).

图2 流式细胞结果. A: 对照组; B: 50 μmol/L celecoxib作用24 h组.

2.4 Bax、Bcl-2免疫组织化学染色

Bcl-2阳性染色主要弥漫性分布于胃癌组织细胞质中, 癌旁组织中也可见少量的表达. Bcl-2蛋白免疫组织化学染色评分为: 48 h对照组0分, 50 µmol/L celecoxib作用48 h组0分, 与对照组比较无统计学意义, Bax阳性反应物位于胞质和胞膜, 呈棕黄色颗粒, Bax蛋白免疫组织化学染色评分为: 48 h对照组0分, 50 µmol/L celecoxib作用48 h组0分, 与对照组比较无统计学意义(图3).

图3 Bax和Bcl-2免疫组织化学染色. A-B: Bax; C-D: Bcl-2. A, C: 50 μmol/L celecoxib作用48 h; B, D: 对照48 h.

2.5 NF-κB蛋白表达

celecoxib对MGC-803细胞分泌NF-κB蛋白有抑制作用, 并且和celecoxib呈浓度和时间相关性(r = 1, 图4).

图4 NF-κB蛋白表达. A: 对照组; B: 50 μmol/L(24 h); C: 50 μmol/L(48 h); D: 100 μmol/L(24 h); E: 100 μmol/L(48 h).

2.6 VEGF蛋白表达

celecoxib对MGC-803细胞分泌VEGF蛋白有抑制作用, 并且和celecoxib呈时间相关性(r = 0.928, P<0.01, 图5).

图5 VEGF蛋白浓度标准曲线.

3 讨论

NSAIDS对消化系肿瘤具有防治作用已有大量的事实, 但其抗癌作用的机制仍不明确, 有研究认为可能与抑制COX这一前列腺素类物质合成的酶, 使前列腺素类物质生成减少有关, 即COX依赖性途径[1-2]. 近来人们发现, NSAIDs也可以在完全缺乏COX活性的细胞发挥抗增殖作用, 故推测可能通过其他途径也可诱导细胞凋亡. 本实验应用MTT方法检测了celecoxib对胃癌MGC-803细胞的生长抑制作用. 结果表明, 随着药物浓度的增加和时间的延长, 细胞存活率逐渐降低, DNA图谱上表现为在G0/G1期前出现一个代表凋亡细胞的亚G1峰. 同正常细胞对比可见G0/G1期细胞比例逐渐增加, S期和G2/M期细胞比例降低. 但是, COX-2蛋白的含量在MGC-803细胞未检测到. Yu et al[3]的研究报道与我们的研究一致, 进一步说明celecoxib抑制细胞生长存在其他途径. 可能是通过COX-2非依赖性途径起作用. 有人报道COX-2非依赖性机制可能与如下途径有关: (1)抑制PPARδ, 诱导肿瘤细胞的凋亡[4], 或激活PPARγ抑制肿瘤细胞的生长[5]; (2)抑制IKKβ-NF-κB信号通路[6-7]; (3)抑制Akt信号通路[8].

本研究中我们通过免疫组织化学方法定性检测Bax及Bcl-2均未见表达, Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素. Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最有代表性的抑亡和促进凋亡基因, 并且Bax是Bcl-2活性的主要调节子[9]. 近年来研究表明Bcl-2和Bax调节细胞凋亡, 取决于自身表达的高低, 还与Bax/Bcl-2的比率有关[10-11]. Bcl-2水平高于Bax时, Bcl-2和Bcl-2形成同源二聚体, 细胞凋亡受抑制; Bax表达高于Bcl-2时, 则形成Bax和Bax同源二聚体, 细胞凋亡增强; 而Bcl-2和Bax水平相当时, 形成Bcl-2Bax二聚体, 细胞凋亡终止. 我们的研究表明, celecoxib诱导不表达COX-2的胃癌MGC-803细胞凋亡发生可能与Bcl-2及Bax无关. 唐保东 et al[12]的研究与我们的研究结果一致.

本组实验中, 我们研究发现celecoxib对细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及NF-κB蛋白均有抑制作用, 并且和celecoxib呈浓度和时间依赖性. VEGF家族有较强的促进新生血管和淋巴管形成作用, 参与病理性、生理性淋巴管和血管新生. 许多因素可调节VEGF的表达, 缺氧及HIF、细胞因子(包括PDGF、bFGF、胰岛素样生长因子、角化细胞生长因子、表皮生长因子、 TNF-α、TGF、IL-1、IL-6)、细胞内介质(包括AP-1转录因子、Ras蛋白和酪氨酸蛋白激酶、VHL、COX-2等)、类固醇激素等均对VEGF的调控产生影响[13-15]. 在某些消化道肿瘤中COX-2表达与VEGF呈正相关, 提示COX-2可能通过诱导VEGF表达上调促进肿瘤生长, UefujiK et al[16]认为COX-2可能产生前列腺素E2, 通过EP受体/cAMP途径来调节肿瘤中VEGF基因转录表达[17]. 本实验中检测celecoxib可抑制MGC-803细胞分泌VEGF, 机制可能通过COX-2非依赖性途径起作用, 具体机制需要进一步深入研究.

NF-κB是一种重要的转录因子蛋白, 研究表明NF-κB除了具有调节炎症、免疫反应相关基因转录作用外, 还可以调节细胞增殖, NF-κB几乎存在于所有细胞,与p50/p65结合形成二聚体[18-19]. 静息状态时, p65与κB抑制蛋白(inhibitory kappaB, IκB)结合, 以非活性状态存在于细胞质中,不具有调节基因转录的能力. 当细胞受到内毒素、病毒蛋白、致癌物等细胞外信号刺激时,蛋白激酶被激活, IκB磷酸化并降解, 从而释放NF-κB二聚体, 使其得以转位进入细胞核中, 与靶基因启动子区域中特定的DNA序列结合, 诱导抗凋亡基因和促生长基因等靶基因的转录[20-21]. 我们的研究发现MGC-803细胞株表达NF-κB活性. 用不同药物浓度的celecoxib处理MGC-803细胞后, Western blot检测结果显示NF-κB蛋白表达较处理前明显降低, 并且和celecoxib呈浓度和时间依赖性. 表明celecoxib可抑制MGC-803细胞NF-κB蛋白的表达, 提示celecoxib可通过抑制NF-κB蛋白的表达, 进而抑制IKKβ-NF-κB信号通路而发挥抗肿瘤作用. Dai et al[21]研究指出胃癌组织中NF-κB蛋白表达与VEGF蛋白表达之间存在正相关关系, 提示在胃癌组织中NF-κB的活化对VEGF的表达具有正向的调节作用. Choi et al[22]实验发现, 用NF-κB反义核苷酸抑制TNF-α诱导的血管生成的同时, 能下调TNF-α介导的bFGF和VEGF的表达, 从而提示NF-κB对VEGF的活性确有潜在的正向调节作用. 这或许是肿瘤细胞中VEGF分泌异常增加的启动机制之一, 也为NF-κB对胃癌发生发展的多向调节作用提供了有力佐证. Starenki et al[23]研究认为NF-κB可通过诱导和上调Bcl-2家族蛋白发挥抑制凋亡作用. Bcl-2启动子上存在NF-κB的特异性结合位点, NF-κB可通过转录途径直接上调Bcl-2表达, 同时还可通过TNF-α、p21WAF1[24]等其他途径促进Bcl-2表达. 在肿瘤细胞中由于NF-κB的活化可以激活含有κB的Bcl-2及Bcl-XL编码基因的转录表达, 而对无κB位点的Bax和Bad基因则无此作用, 这就可能使得两类不同功能的蛋白表达量失衡, 从而增强肿瘤细胞的抗凋亡性. 抑制NF-κB活性可抑制Bcl-2的表达, 进而诱导肿瘤细胞凋亡[25].

我们的研究结果提示celecoxib可抑制MGC-803细胞的生长, 并可抑制NF-κB及VEGF蛋白的表达, 此可能为celecoxib抑制肿瘤细胞增殖, 促进细胞凋亡, 抑制肿瘤新生血管形成以及预防肿瘤发生等抗肿瘤作用的一种机制.

评论

背景资料

COX-2在恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用, COX-2可能成为化学预防和化学辅助治疗恶性肿瘤的新靶点. 塞来昔布(celecoxib)是一种选择性COX-2抑制剂, 可抑制多种肿瘤细胞增殖, 促进细胞凋亡, 他的上述作用机制尚未完全阐明, 可能存在不依赖COX-2的机制.

同行评议者

傅春彬, 主任医师, 吉化集团公司总医院一院消化内科.

研发前沿

塞来昔布作为选择性COX-2抑制剂抗肿瘤药, 已成为近年恶性肿瘤化学预防和治疗的研究热点.

相关报道

Yu et al报道celecoxib诱导不表达环氧合酶-2的胃癌MGC-803细胞凋亡发生可能与Bcl-2及Bax无关. Ghosh et al报道可能存在COX-2非依赖性机制. Narayanan et al发现celecoxib能抑制模型动物肿瘤生长, 其作用机制是通过抑制NF-κB和COX-2活性表达而实现.

同行评价

本文具有科学性、创新性和可读性, 能较好地反映我国胃癌基础研究的先进水平.

备注

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

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