胰岛素样生长因子1对大鼠结肠平滑肌细胞中干细胞因子表达的影响

摘要

目的: 探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)对大鼠结肠平滑肌细胞(SMC)表达干细胞因子(SCF)的影响.

方法: 酶解法分离培养SD大鼠结肠SMC、α-actin免疫荧光鉴定, 然后将大鼠结肠SMC随机分为IGF-1不同浓度(0、5、10、50、100、150 μg/L)、时间(0、8、16、24、48 h)及IGF-1α受体(IGF-1Rα)抗体(0、50、100、150 μg/L)干预组; Western blot、RT-PCR法检测SMC合成SCF的变化.

结果: 低剂量IGF-1(5、10 μg/L)对SCF蛋白和mRNA表达无影响(P>0.05), 中高剂量IGF-1(50、100、150 μg/L)诱导其表达增加(均P<0.05), 100 μg/L可能为体外最大有效浓度(0.820±0.061 vs 0.167±0.015; 1.269±0.219 vs 0.560±0.023, 均P<0.05), 且其促SCF蛋白和mRNA合成的最高峰在第16小时(0.420±0.034 vs 0.209±0.001; 1.407±0.133 vs 0.477±0.041, 均P<0.05), IGF-1Rα抗体可抑制SCF蛋白和mRNA合成, 抑制作用呈浓度依赖性(P<0.05).

结论: IGF-1能通过作用于SMC上的IGF-1受体刺激大鼠结肠SMC内SCF的表达.

关键词: 胰岛素样生长因子1; 平滑肌细胞; 干细胞因子; 受体; 抗体

Insulin-like growth factor-1 upregulates the expression of stem cell factor in rat colonic smooth muscle cells

Yue-Ji Ning, Wei Zhang, Jia-Fei Cheng, Xue-Liang Li, Mei-Feng Wang, Lin Lin

Yue-Ji Ning, Wei Zhang, Jia-Fei Cheng, Xue-Liang Li, Mei-Feng Wang, Lin Lin, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Supported by: the National Program on Key Basic Research Project (973 Program), No. 2006CB503908; and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2008466.

Correspondence to: Professor Lin Lin, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 300 Guangzhou Road, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. lin9100@yahoo.com.cn

Received: October 26, 2009
Revised: November 22, 2009
Accepted: November 23, 2009
Published online: December 8, 2009

Abstract

AIM: To investigate the effects of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) on the expression of stem cell factor (SCF) in rat colonic smooth muscle cells (SMCs).

METHODS: Rat colonic SMCs were separated, cultured, and identified by immunofluorescence staining of α-actin. Cultured colonic SMCs were divided into IGF-1 treatment group and IGF-1 receptor antibody intervention group. Cells in the IGF-1 treatment group incubated with different concentrations (0, 5, 10, 50, 100 and 150 μg/L) of IGF-1 for different durations (0, 8, 16, 24 and 48 hours), while those in the IGF-1 receptor antibody intervention group were treated with IGF-1 and different concentrations of IGF-1 receptor monoclonal antibody (0, 50, 100 and 150 μg/L). The expression of SCF in colonic SMCs was examined by Western blot and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction.

RESULTS: Although IGF-1 at low concentrations (5 and 10 μg/L) had no significant impact on the expression of SCF mRNA and protein in SMCs (all P > 0.05), IGF-1 at moderate or high concentrations (50, 100 and 150 μg/L) significantly upregulated the expression of SCF mRNA and protein (all P < 0.05). The optimum concentration of IGF-1 to upregulate SCF expression in vitro was 100 μg/L (0.820 ± 0.061 vs 0.167 ± 0.015 and 1.269 ± 0.219 vs 0.560 ± 0.023, respectively; both P < 0.05), and the peak expression of SCF occurred 16 hours after incubation with IGF-1 (0.420 ± 0.034 vs 0.209 ± 0.001 and 1.407 ± 0.133 vs 0.477 ± 0.041, respectively; both P < 0.05). IGF-1 receptor monoclonal antibody could inhibit the expression of SCF in SMCs in a dose-dependent manner (all P < 0.05).

CONCLUSION: IGF-1 can upregulate the expression of SCF in colonic SMCs perhaps in an IGF-1 receptor-dependent manner.

Key Words: Insulin-like growth factor-1; Smooth muscle cell; Stem cell factor; Receptor; Antibody

0 引言

Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal, ICC)是胃肠动力的起搏细胞, 且调节电活动的扩布和参与神经冲动的传导[1-2]; 许多胃肠动力障碍性疾病与胃肠道ICC的缺失或病变有关[3-7]. 干细胞因子(stem cell factor, SCF)是一种多功能细胞因子, 是胃肠道ICC生长、功能及表型维持的主要调控因子, 胃肠动力性疾病中SCF下降可能是ICC数量减少和超微结构改变的直接原因[8-10]. 研究发现[11], 胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)可能通过胃平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)调控SCF的合成, 进而对胃ICC具有保护作用. 我们前期实验发现, IGF-1能促进体外培养的胃SMC合成SCF, 其对结肠SMC的作用不清楚, 本研究从细胞水平探讨IGF-1对大鼠结肠SMC表达SCF的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠, 雌雄不拘, 体质量150-200 g, 由南京医科大学医学实验动物中心提供. DMEM培养液、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶、大豆胰蛋白酶抑制剂(Gibco, USA), 重组大鼠IGF-1(R&D, UK), IGF-IRα抗体(Abcam, UK), SCF抗体(Santa Cruz, USA), α-actin抗体(北京博奥森公司), SCF引物(南京博尔迪生物科技公司).

1.2 方法

1.2.1 结肠SMC的分离和培养: SD大鼠断椎处死, 快速自肛门上2 cm取结肠10 cm左右, 用含抗生素的Hepes-Ringer缓冲液反复冲洗, 去除黏膜层和浆膜层. 将平滑肌组织剪碎匀浆, 置入消化液(0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.01%的大豆胰蛋白酶抑制剂)中, 30 ℃孵育20 min、离心、弃消化液, 反复2次, 加含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中止消化、离心, DMEM培养液重悬细胞, 过筛; 台盼蓝染色确认细胞活力>90%, 于37 ℃ 950 mL/L O₂和50 mL/L CO₂条件下培养, SMC长至致密单层时, 传代培养. 采用第3-5代SMC进行实验.

1.2.2 结肠SMC的鉴定: 取对数生长的SMC, 胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液; 将SMC接种到放置载玻片的培养皿中, 置CO₂孵箱中培养1-3 d, 待SMC长至单层时, 取出载玻片. PBS冲洗、丙酮固定, 3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶; 滴加α-actin一抗(1:100), 4 ℃过夜, PBS冲洗, 滴加罗丹明标记的羊抗兔IgG二抗, 室温避光湿盒中孵育1 h, PBS冲洗, 滴加Hoechst染核, PBS冲洗、封片, 观察特异性荧光.

1.2.3 分组与处理: 将2.5×10⁸/L的SMC接种于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中培养至融和后, PBS洗涤, 加入无胎牛血清的培养基饥饿24 h. 分组: IGF-1不同时间组、IGF-1不同浓度组、IGF-1+不同浓度IGF-1Rα抗体组. IGF-1不同时间组: SMC+IGF-1(100 μg/L), 分别培养0, 8, 16, 24和48 h. IGF-1不同浓度组: SMC+IGF-1(0, 5, 10, 50, 100, 150 μg/L)培养16 h. IGF-1+IGF-1R抗体组: SMC+IGF-1(100 μg/L)与不同浓度的IGF-1R抗体(0, 50, 100, 150 μg/L)培养16 h. 以上实验重复3次.

1.2.4 Western blot法检测SMC中SCF蛋白: 蛋白裂解液提取各组细胞蛋白, BCA法测定蛋白浓度. 60 μg蛋白/泳道加样恒流30 mA电泳, 恒压100 V转膜55 min, 封闭2 h. 加入SCF一抗(1:100), 4 ℃过夜; 二抗1:5000, 37 ℃孵育, 曝光、显影.

1.2.5 RT-PCR法检测SMC中SCF mRNA: 按TRIzol试剂说明提取各组细胞总mRNA, 逆转录为cDNA, 以此cDNA为模板行PCR扩增. PCR反应条件: 94 ℃预变性5 min、94 ℃变性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s、共循环30次, 最后于72 ℃延伸8 min, PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳, 观测、拍照. SCF上游引物: 5'-TTCGCTTGTAATTGGCTTTGC-3'; 下游引物5'-CAACTGCCCTTGTAAGACTTGA-3'(76 bp, NM_021843); GAPDH上游引物: 5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'; 下游引物5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'(118 bp, BC059110).

统计学处理 所有数据录入SPSS10.0软件包分析, 以mean±SD表示, 采用方差分析和成组t检验, P<0.05为有显著性差异.

2 结果

2.1 结肠SMC培养和鉴定

结肠SMC培养24 h后, 可见细胞贴壁, 呈三角形或梭形, 有少量突起; 3-5 d开始增殖(图1A); 14 d后细胞密集, 呈峰谷样生长(图1B). α-actin免疫荧光阳性反应: 大部分多角形细胞胞质内见红色荧光, 细胞核Hoechst染色呈蓝色(图1C).

图1 结肠SMC的培养与鉴定. A: 结肠SMC培养3-5 d, 开始增殖(×100); B: 结肠SMC培养14 d, 细胞密集, 峰谷样生长(×100); C: 结肠SMC免疫荧光鉴定(×400).

2.2 不同浓度IGF-1对结肠SMC中SCF蛋白和mRNA的影响

低浓度IGF-1(5, 10 μg/L)对SMC中SCF蛋白和mRNA表达无影响(P>0.05, 表1, 图2), IGF-1在50 μg/L时, SCF表达增加(P<0.05, 表1, 图2), 在100 μg/L时表达最多(P<0.05, 表1, 图2), 150 μg/L时仍显著促进SCF蛋白和mRNA的表达(类似100 μg/L时, P<0.05, 表1, 图2).

表1 不同浓度IGF-1对结肠SMC的SCF蛋白和mRNA的影响 (mean±SD).

分组	蛋白	mRNA
IGF-1(μg/L)
0	0.167±0.015	0.560±0.023
5	0.163±0.021	0.624±0.026
10	0.183±0.051	0.683±0.049
50	0.480±0.036a	0.926±0.025a
100	0.820±0.061c	1.269±0.219c
150	0.807±0.090	1.212±0.299

^aP<0.05 vs 其他各组;

^cP<0.05 vs IGF-1(0, 5, 10, 50 μg/L).

图2 不同浓度IGF-1对结肠SMC内SCF蛋白和mRNA表达的影响. A: 蛋白; B: mRNA; 0: 50 bp DNA Marker; 1: IGF-1 0 μg/L; 2: IGF-1 5 μg/L; 3: IGF-1 10 μg/L; 4: IGF-1 50 μg/L; 5: IGF-1 100 μg/L; 6: IGF-1 150 μg/L.

2.3 IGF-1作用时间对结肠SMC中SCF蛋白和mRNA的影响

IGF-1在100 μg/L时, 促进SMC内SCF蛋白和mRNA的表达呈时间依赖性地升高, 16 h达最高(P<0.05, 表2, 图3), 此后逐渐下降; 48 h与0 h对SCF作用无统计学差异(P>0.05, 表2, 图3).

表2 100 μg/L IGF-1不同时间刺激对结肠SMC中SCF蛋白及mRNA影响 (mean±SD).

分组	蛋白	mRNA
0 h	0.209±0.001	0.477±0.041
8 h	0.344±0.007a	0.963±0.083a
16 h	0.420±0.034c	1.407±0.133c
24 h	0.328±0.023	0.977±0.084
48 h	0.182±0.058	0.575±0.075

^aP<0.05 vs 100 μg/L IGF-1(0, 16, 48 h);

^cP<0.05 vs 其他各组.

图3 IGF-1刺激时间对结肠SMC内SCF蛋白和mRNA表达的影响. A: 蛋白; B: mRNA; 0: 50 bp DNA Marker; 1: IGF-I刺激0 h; 2: IGF-I刺激8 h; 3: IGF-I刺激16 h; 4: IGF-I刺激24 h; 5: IGF-I刺激48 h.

2.4 不同浓度的IGF-1R抗体对IGF-1诱导SCF蛋白和mRNA的影响

加入IGF-1(100 μg/L)与不同浓度的IGF-1R(IGF-1Rα)抗体后, 随抗体浓度的增高, SCF蛋白和mRNA的表达愈加减少, 各浓度组之间有统计学差异(P<0.05, 表3, 图4).

表3 不同浓度IGF-1R抗体对结肠SMC中SCF蛋白及mRNA影响 (mean±SD).

分组	蛋白	mRNA
0 μg/L	1.690±0.056	0.180±0.010
50 μg/L	1.277±0.072a	0.130±0.000a
100 μg/L	1.077±0.055a	0.077±0.005a
150 μg/L	0.787±0.055a	0.033±0.058a

^aP<0.05 vs 其他各组.

图4 不同浓度IGF-1R抗体对结肠SMC内SCF蛋白和mRNA表达的影响. A: 蛋白; B: mRNA; 0: 50 bp DNA Marker; 1: IGF-1R抗体0 μg/L; 2: IGF-1R抗体50 μg/L; 3: IGF-1R抗体100 μg/L; 4: IGF-1R抗体150 μg/L.

3 讨论

ICC以网络状分布于胃肠神经末梢及平滑肌之间, ICC、肠神经细胞和SMC构成"功能元件", 共同调控胃肠道的各种生理功能. 研究已证实ICC的缺失或病变是胃肠动力障碍重要原因之一, 包括糖尿病胃肠病变时, 均存在ICC破坏[3-7].

SCF是c-kit的天然配体, SCF与kit结合后形成SCF-kit信号系统, 在造血细胞、肥大细胞、生殖细胞以及黑色素细胞的发育中起关键作用, 研究证实[9-10,12], SCF在胃肠道ICC的发育、增殖和表型维持过程中起关键作用, SCF减少与胃肠动力相关的ICC异常有关. 人体SCF可由成纤维细胞、角蛋白细胞、内皮细胞、骨髓、小细胞肺癌细胞等产生, 胃肠道SCF可来自SMC、肠神经元细胞, 研究发现[11], 维持胃肠ICC所需的SCF可能来源于胃肠SMC. 大量研究表明[3,13-16], IGF-1、一氧化氮(NO)、5-HT、血红素氧化酶-1(HO-1)及IL-9等因素均与ICC的生存和表型维持有关. 但IGF-1保护胃肠ICC的分子机制不清? Horváthet al[11]离体培养DM小鼠胃窦和胃体组织, 给予胰岛素或IGF-1, 可完全阻止ICC的减少, 认为DM病程中, 胃SMC萎缩、合成SCF减少, 导致ICC病变, 因此推测IGF-1刺激胃SMC表达SCF, 进而对ICC起调控作用. 我们前期实验提示, 体外培养胃SMC, 给予IGF-1可促进SCF表达增加. 由于胃肠道不同部位ICC的分布不同, 且胃肠道不同部位及不同亚型的ICC对SCF的需求量亦不同[17-19], 因此, 结肠SMC在IGF-1作用下是否表达SCF增加, 还不清楚. 本实验培养结肠SMC显示, 中高剂量的IGF-1可明显促进结肠SMC合成SCF, 且体外IGF-1在100 μg/L、作用16 h, 促进结肠SMC合成SCF的作用最强, 提示IGF-1以浓度和时间依赖性方式诱导结肠SMC表达SCF.

IGF-1是胰岛素样生长因子家族中的一种, 含70个氨基酸, 相对分子质量为7649 Da, 主要由肝脏分泌, 以内分泌、自分泌、旁分泌的方式, 与靶细胞表面的IGF-1R结合, 对外周组织、细胞起生理和病理调节作用[20]. IGF-1R是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白质, 包括两个α亚基和两个β亚基, α亚基位于细胞膜外侧, β亚基位于细胞膜内侧, IGF-1首先与α亚基结合, 激活β亚基上的酪氨酸激酶, 使之磷酸化, 引起胞质内一系列的信号级联反应和基因转录, 从而产生IGF-1的生物学效应. 本实验中, IGF-1Rα抗体以浓度依赖性的方式抑制结肠SMC合成SCF, 提示IGF-1可与结肠SMC胞膜上IGF-1Rα结合, 促进SCF的合成.

总之, 本实验初步证实了体外IGF-1可诱导结肠SMC产生SCF, 且可能通过SMC上的IGF-1受体. IGF-1使SMC表面的IGF-1R磷酸化后, 引起的细胞内机制尚待进一步研究. 为进一步探讨SCF的调控、相应的干预方法、促使SCF的合成以及为ICC的保护、治疗胃肠动力障碍提供了实验依据.

评论

背景资料

胃肠动力障碍性疾病的发病机制目前仍不清楚, 临床缺乏有效的治疗手段, 随着对ICC间质细胞功能的研究日益增多, 发现IGF-1是ICC间质细胞的保护因子. IGF-1有望成为治疗该病新的突破口.

同行评议者

宛新建, 副教授, 上海市第一人民医院消化内科

相关报道

Horvath et al离体培养糖尿病小鼠胃窦和胃体组织, 给予IGF-1, 可完全阻止ICC间质细胞的减少. 该研究提示IGF-1可能刺激平滑肌细胞表达干细胞因子, 进而对ICC间质细胞起调控作用.

创新盘点

本研究首次在体外培养结肠平滑肌细胞, 应用外源性IGF-1对结肠平滑肌细胞进行干预, 结果验证了其对结肠平滑肌细胞产生干细胞因子的显著影响.

应用要点

本研究证实了, IGF-1能通过作用于SMC上的IGF-1受体刺激大鼠结肠SMC内SCF的表达, 为临床治疗胃肠动力障碍性疾病提供新的理论依据.

同行评价

本研究的内容具有重要的价值和新颖性, 客观地反映了IGF-1对结肠SMC表达SCF的影响, 有较好的可读性.

备注

编辑: 李军亮 电编: 何基才

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