临床经验 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2009. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2009-01-28; 17(3): 329-332
在线出版日期: 2009-01-28. doi: 10.11569/wcjd.v17.i3.329
干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效与HBV基因型的关系
黄重发, 施斌斌, 朱清, 武凌, 裴小红, 朴全慧, 周怿
黄重发, 施斌斌, 朱清, 武凌, 裴小红, 朴全慧, 周怿, 中国人民解放军第四五四医院消化科 江苏省南京市 210002
基金项目: 南京军区医学卫生科研课题资助项目, No. 07M047.
作者贡献分布: 实验路线设计由黄重发操作完成; 实验技术由施斌斌操作完成, 统计学分析由朱清完成, 临床资料由武凌, 裴小红, 朴全慧及周怿负责收集整理; 论文写作由施斌斌完成.
通讯作者: 施斌斌, 210002, 江苏省南京市, 中国人民解放军第四五四医院消化科. shibinbin1974@sina.com
电话: 025-80865270
收稿日期: 2008-11-19
修回日期: 2008-12-19
接受日期: 2008-12-22
在线出版日期: 2009-01-28

目的: 探讨HBV不同基因型对干扰素抗病毒治疗的影响.

方法: 对30名HBV患者进行干扰素抗病毒治疗, PCR-RFLP检测HBV基因型, 观察不同基因型HBV对干扰素的应答水平.

结果: 30例患者HBV基因型以B型(40.0%)和C型(56.67%)为主, C型患者HBV DNA水平显著高于B型患者(6.03±1.35 vs5.45±1.21, P<0.05), B型患者对干扰素应答率显著高于C型患者, 在无应答患者中分别有1名B型和C型转变为D型.

结论: HBV基因型与HBV DNA复制水平、抗病毒疗效均有一定的相关性, 在治疗过程中可发生基因型改变.

关键词: 乙型肝炎病毒; 基因型; 基因型改变; 抗病毒治疗
引文著录: 黄重发, 施斌斌, 朱清, 武凌, 裴小红, 朴全慧, 周怿. 干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效与HBV基因型的关系. 世界华人消化杂志 2009; 17(3): 329-332
Relationship between therapeutic efficacy of interferon in treating chronic hepatitis B and HBV genotypes
Chong-Fa Huang, Bin-Bin Shi, Qing Zhu, Ling Wu, Xiao-Hong Pei, Quan-Hui Pu, Yi Zhou
Chong-Fa Huang, Bin-Bin Shi, Qing Zhu, Ling Wu, Xiao-Hong Pei, Quan-Hui Pu, Yi Zhou, Department of Gastroenterology, the 454th Hospital of Chinese PLA, Nanjing 210002, China
Supported by: the Nanjing Military Area Command of Chinese PLA Scientific Research Foundation, No. 07M047.
Correspondence to: Bin-Bin Shi, Department of Gastroenterology, the 454th Hospital of Chinese PLA, Nanjing 210002, China. shibinbin1974@sina.com
Received: November 19, 2008
Revised: December 19, 2008
Accepted: December 22, 2008
Published online: January 28, 2009

AIM: To study the effects of HBV genotypes on anti-virus-therapeutic efficacy of interferon in chronic HBV-infected patients.

METHODS: Thirty HBV-infected patients were treated with interferon for anti-virus. HBV genotypes were detected using PCR-RFLP and the response levels of interferon in different genotypes were observed.

RESULTS: For the 30 patients, the HBV genotypes were mainly type B (40.0%) and type C (56.67%). Level of HBV DNA was significantly higher in patients with type C than with type B (6.03 ± 1.35 vs 5.45 ± 1.21, P < 0.05), and the interferon response rate was higher in patients with type B than with type C. Among those with no response, 1 case with type B and another case with type C changed into type D.

CONCLUSION: It is suggested that HBV genotypes is correlated with the serum levels of HBV DNA and therapeutic efficacy of interferon. The genotype could be changed during the process of therapy.

Key Words: Hepatitis B Virus; Genotype; Genotype changes; Anti-virus therapy
0 引言

根据乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)全基因序列异质量性≥8%的界线, HBV基因型可以分为8型(A-H)[1]. HBV的不同基因型的结构差异可影响慢性乙型肝炎患者的病情发展、转归、HBV标志物的表达, 以及对抗病毒药物治疗的疗效. 本研究旨在探讨干扰素抗病毒治疗应答与HBV基因型及基因型转换之间的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

本研究30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者为我院门诊于2007-08/2008-05就诊的慢性乙型肝炎患者, 诊断符合2000年西安全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准[2]. 其中男20例, 女10例, 年龄17-53(平均年龄33.6±8.6)岁. 所有受检者排除HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染, 排除近3 mo应用抗病毒或影响免疫功能的药物. PCR扩增所用Taq酶、dNTP等是北京鼎国生物产品, 限制性内切酶是Promega公司产品. PCR扩增仪是美国ABI公司PE GeneAmp PCR System 9700, 引物由上海英骏公司提供. HBV DNA定量检测仪为Roche Lightcycler(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis), 检测灵敏度为103 copies/mL, 引物及探针为深圳匹基公司产品.

1.2 方法

1.2.1 治疗方案: 干扰素治疗α2b 5 MU/d肌注1 mo后改为隔日1次, 疗程6 mo. 治疗效果分为完全应答、部分应答、无应答. 完全应答: 血清HBV DNA<103拷贝/mL, HBeAg阴转(或HBeAg/抗Hbe血清转换), ALT复常; 部分应答: HBV DNA<103 copies/mL, 肝功能正常, 无HBeAg血清转换; 无应答: 未达到以上应答者. 完全应答和部分应答者为有效, 无应答者为无效. 观察项目: 患者治疗前、治疗后1、3、6 mo各复查一次血常规、肝功能、乙型肝炎血清标志物、HBV DNA(Roche荧光PCR定量). 治疗前及治疗结束后分别行基因型测定.

1.2.2 聚合酶链式反应联合限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测HBV基因型: 用巢式PCR扩增S基因: 第一轮引物为BS1/POL2, 20 μL体系, 反应参数94℃ 1 min, 94℃ 20 s, 55℃ 20 s, 72℃ 40 s, 72℃ 5 min, 35个循环; 第二轮引物为YS1/YS2, 30 μL体系, 反应参数94℃ 1 min, 94℃ 20 s, 55℃ 20 s, 72℃ 25 s, 72℃ 3 min, 32个循环. 得到S基因nt48-633之间片段长度为585 bp. 将PCR产物于琼脂糖凝胶电泳, 所有阳性产物以限制性内切酶BsrⅠ和StyⅠ平行酶切于37℃水浴4 h, 酶切体系15 μL, 底物为10 μL. 之后于琼脂糖凝胶电泳. 结果显示: 若单以BsrⅠ切开者为B型, 若单以StyⅠ切开者为C型, 若两酶同时切开者为A型, 若两酶同时切不开者为D型. PCR所用引物见表1.

表1 PCR引物及核苷酸序列.
引物序列位置
BS1 sense5'-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC-3'56-76
Pol2 antisense5'-CGGGCAACGGGGTAAAGGTTC-3'1158-1138
YS1 sense5'-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3'203-221
YS2 antisense5'-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3'787-767

统计学处理 用SPSS12.0统计软件进行分析, 计数资料用χ2检验.

2 结果
2.1 基因分型

干扰素治疗前, 30例患者中HBV基因型40.0%(12/30)B型, C型56.67%(17/30), D型3.33%(1/30). 干扰素治疗后, 30例患者中HBV基因型B型36.67%(11/30)B型, C型53.3%(16/30), D型10.0%(3/30), 其中1名B基因型和1名C基因型治疗无应答者治疗结束后均转换为D基因型. 酶切图谱见图1.

图1
图1 干扰素治疗后基因型的转变. A: 基因型B→基因型D; B: 基因型C→基因型D.
2.2 基因型与HBV DNA的关系

C基因型HBV DNA对数值6.03±1.35, B基因型HBV DNA对数值为5.45±1.21, C基因型显著高于B基因型(P<0.05, 表2).

表2 HBV基因型与HBV DNA之间的关系.
基因型(n)ALT(U/L)HBV DNA(Log)
B(12)86.24±17.455.45±1.21
C(17)93.99±23.816.03±1.35a
aP<0.05 vs B基因型.
2.3 基因型与干扰素疗效的关系

干扰素治疗有效率40%, 其中B基因型58.33%, C基因型29.41%, D基因型1例治疗无应答(表3).

表3 不同HBV基因型与干扰素疗效的关系.
治疗前HBV基因型有效率治疗后HBV基因型
B 40%(12/30)58.33%(7/12)B(11)
C 56.7%(17/30)29.41%(5/17)aC(16)
D 3.33%(1/30)0%D(3)
aP<0.05 vs B基因型.
3 讨论

HBV具有病毒复制产量高和突变率高的特征, 长期点突变累积形成了不同的基因型. 随着近年来新的HBV基因型的发现, 国内外学者从病毒学、流行病学和临床医学等方面对HBV基因型进行了大量的研究[3-4]. HBV基因型分布呈现一定的地域性, A分布于全球, B和C型主要在亚洲, D型分布于南欧, E型分布于非洲, F型分面于美国, G型分布于美国和法国, H型分布于中美洲[5]. 经继生 et al[6]报道江苏地区HBV基因型主要是B型(33.5%)和C型(61.4%), 其中南京地区B型(50.0%)和C型(45.0%), 未检测出A和D基因型. 我们研究发现南京地区HBV基因型B型(40.0%)和C型(56.67%), 未报道有D基因型, 而我们检测出1例患者为D基因型HBV, 追问病史, 此患者为西藏地区人, 大学毕业后来南京工作. 本次研究结果与上述所道结果相似.

日本学者[7]报道C型HBV感染与乙型病毒性肝炎的慢性化相关, C型的HBeAg阳性率及血清HBVDNA水平较B型高. 国内学者也有类似报道[8]. 本次研究也进一步证实上述结果, 而B型和C型两组间ALT无显著性差异. 这可能是C型对干扰素治疗应答率较B型低的原因. 提示C型HBV可通过本身活跃的复制能力和变异能力, 逃避宿主免疫和药物的双重压力, 而维持较高的病毒血症.

不同基因型HBV感染对抗病毒的反应不同. 干扰素治疗HBV感染的分子病毒学机制仍有许多是未知的. 欧美学者研究发现, 干扰素治疗后的疗效, HBV基因型C型较B型差, 基因型A型要比D型要好, HBeAg血清转换后有较高的HBV清除率, 且可获得较高的持续应答, 并有较好的组织学炎症改善[9-10]. 亚洲学者[11]报道, 对于亚洲患者来说, 相比感染了C基因型HBV的患者, 感染了HBV B基因型患者可以在较早的年龄发生HBeAg血清转换, 较少发生严重肝脏疾病, 且对干扰素治疗有更好的反应. 我们本次实验中发现, B基因型患者相较C基因型患者对干扰素有更高的应答率, 两者间具有显著性著异(P<0.05), 进一步证实此观点. 而本次实验中1例D基因型患者干扰素治疗无效, 因例数少, 尚有待进一步观察. 提示HBV DNA基因型是预测乙型肝炎患者干扰素疗效及预后的重要指标之一.

国外学者研究发现在干扰素治疗复发的部分CHB患者中发生了HBV基因型的漂移, 主要有基因型C转变为基因型A[12]. 在另一研究中发现, 急性乙型肝炎在HBeAg血清转换过程中, 出现C基因型转变为B基因型[13]. 在我们此次研究中, 在干扰素治疗无应答者中, 初始为B基因型和C基因型的患者各有1名, 治疗结束后改变为D基因型, 而在治疗完全应答和部分应答者未检出D基因型. 在HBeAg血清转换者中未发现有C基因型转变为B基因型.

部分患者HBV可能为两种基因型的HBV混合感染, 但用目前标准基因型检测方法可能只能检测出其中主要的基因型, 但次要基因型尚不能检测出来, 且主要基因型和次要基因型各自所占比例不能准确测定. 不同基因型的混合感染在欧洲多表现为A型和D型之间, 在东亚可以发生于B和C基因型之间[14]. 本实验中2名无应答者发生基因型漂移, 可能此2名患者原为HBV混合感染, 但因检测技术问题, 次要基因型未能检测出来. 在同一个患者身上发生基因型漂移的原因尚未明确, 干扰素治疗后基因型的漂移可能是免疫选择的结果, 由于机体免疫压力改变的作用影响, 推测这种免疫压力的改变可能更主要对不同基因型HBV混合感染中的主要基因型产生作用, 而次要基因型可以获得替代从而成为主要基因型.

不同基因型存在着生物学特性和临床特点差异, 对抗病毒治疗疗效存在一定的影响, 抗病毒治疗可致HBV基因型的发生改变, 并对疗效产生影响, 其具体机制有待进一步研究.

评论
背景资料

乙型肝炎病毒(HBV)感染具有很高的发病率, 是引起肝硬化和肝癌的最常见的原因之一. 不同HBV基因型病毒复制水平不同, 影响干扰素抗病毒治疗疗效, 在治疗过程中可能会出现基因型的转变, 其分子病毒学机制尚未明确.

同行评议者

张占卿, 主任医师, 上海市(复旦大学)公共卫生中心; 李定国, 教授, 上海交通大学医学院(原上海第二医科大学)附属新华医院消化内科.

研发前沿

目前对HBV基因型的研究受到越来越多的关注, 不同HBV基因型对抗病毒治疗应答率有显著的差异, 基因型的转变可能是影响疗效的因素之一.

相关报道

国内外研究显示, C型的HBeAg阳性率及血清HBV DNA水平较B型高, 对干扰素抗病毒疗效, HBV基因型C型较B型差, 基因型D型要比A型要差. 国外学者研究发现抗病毒治疗过程中发现有基因型C转变为基因型A.

同行评价

本研究选题和研究内容符合当前研究热点, 有一定应用和研究参考价值, 但不够新颖.

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

1.  Kato H, Gish RG, Bzowej N, Newsom M, Sugauchi F, Tanaka Y, Kato T, Orito E, Usuda S, Ueda R. Eight genotypes (A-H) of hepatitis B virus infecting patients from San Francisco and their demographic, clinical, and virological characteristics. J Med Virol. 2004;73:516-521.  [PubMed]  [DOI]
2.  中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案. 中华肝脏病杂志. 2000;8:324-329.  [PubMed]  [DOI]
3.  Arauz-Ruiz P, Norder H, Robertson BH, Magnius LO. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. J Gen Virol. 2002;83:2059-2073.  [PubMed]  [DOI]
4.  Kidd-Ljunggren K, Miyakawa Y, Kidd AH. Genetic variability in hepatitis B viruses. J Gen Virol. 2002;83:1267-1280.  [PubMed]  [DOI]
5.  Sugauchi F, Orito E, Ichida T, Kato H, Sakugawa H, Kakumu S, Ishida T, Chutaputti A, Lai CL, Ueda R. Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype C over the precore region plus the core gene. J Virol. 2002;76:5985-5992.  [PubMed]  [DOI]
6.  经 继生, 黄 培, 阮 成荣, 马 洁, 汪 顺才, 吴 国强, 谢 志萍, 朱 传武, 章 幼栾, 王 开林. 江苏省乙型肝炎病毒基因型分布与临床相关性. 江苏大学学报(医学版). 2006;16:123-126.  [PubMed]  [DOI]
7.  Duong TN, Horiike N, Michitaka K, Yan C, Mizokami M, Tanaka Y, Jyoko K, Yamamoto K, Miyaoka H, Yamashita Y. Comparison of genotypes C and D of the hepatitis B virus in Japan: a clinical and molecular biological study. J Med Virol. 2004;72:551-557.  [PubMed]  [DOI]
8.  陈 进宇, 王 鲁文, 龚 作炯. HBV基因型与干扰素抗病毒疗效的关系. 中西医结合肝病杂志. 2005;15:68-71.  [PubMed]  [DOI]
9.  Halfon P, Bourlière M, Pol S, Benhamou Y, Ouzan D, Rotily M, Khiri H, Renou C, Pénaranda G, Saadoun D. Multicentre study of hepatitis B virus genotypes in France: correlation with liver fibrosis and hepatitis B e antigen status. J Viral Hepat. 2006;13:329-335.  [PubMed]  [DOI]
10.  Erhardt A, Blondin D, Hauck K, Sagir A, Kohnle T, Heintges T, Häussinger D. Response to interferon alfa is hepatitis B virus genotype dependent: genotype A is more sensitive to interferon than genotype D. Gut. 2005;54:1009-1013.  [PubMed]  [DOI]
11.  Chu CJ, Hussain M, Lok AS. Hepatitis B virus genotype B is associated with earlier HBeAg seroconversion compared with hepatitis B virus genotype C. Gastroenterology. 2002;122:1756-1762.  [PubMed]  [DOI]
12.  Hannoun C, Krogsgaard K, Horal P, Lindh M. Genotype mixtures of hepatitis B virus in patients treated with interferon. J Infect Dis. 2002;186:752-759.  [PubMed]  [DOI]
13.  Chen BF, Liu CJ, Jow GM, Chen PJ, Kao JH, Chen DS. Evolution of Hepatitis B virus in an acute hepatitis B patient co- infected with genotypes B and C. J Gen Virol. 2006;87:39-49.  [PubMed]  [DOI]
14.  Bowyer SM, Sim JG. Relationships within and between genotypes of hepatitis B virus at points across the genome: footprints of recombination in certain isolates. J Gen Virol. 2000;81:379-392.  [PubMed]  [DOI]