临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2009-09-28; 17(27): 2791-2797
在线出版日期: 2009-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v17.i27.2791
Hep Par 1、CD34及Cytokeratin在血清AFP阴性肝细胞癌诊断中的应用
张婷, 陈旭东, 何松, 王旗春
张婷, 王旗春, 湖州师范学院医学院 浙江省湖州市 313000
陈旭东, 何松, 南通市肿瘤医院 江苏省南通市 226001
张婷, 硕士, 主要从事肿瘤病理学研究.
作者贡献分布: 张婷与陈旭东对此文所作贡献均等; 此课题由陈旭东设计; 研究过程由张婷与陈旭东操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由陈旭东及何松提供; 数据分析由张婷完成; 本论文写作由张婷与王旗春完成.
通讯作者: 张婷, 313000, 浙江省湖州市学士路1号, 湖州师范学院医学院. grape_chang@163.com
电话: 0572-2322569
收稿日期: 2009-07-01
修回日期: 2009-08-30
接受日期: 2009-09-07
在线出版日期: 2009-09-28

目的: 探讨Hep Par 1、CD34及Cytokeratin在血清[AFP(-)HCC]诊断及其在ICC、MAC鉴别诊断中的意义.

方法: 选取南通市肿瘤医院1989-2007年手术切除的70例[AFP(-)HCC]、6例ICC及24例MAC的石蜡标本, 免疫组织化学染色法检测Hep Par 1、CD34及Cytokeratin在血清[AFP(-)HCC]中的表达.

结果: Hep Par 1、CD34在血清AFP(-)HCC、ICC及MAC中的表达差异性均具有显著统计学意义(Hep Par 1: χ2 = 50.7937、9.5745及37.4532; CD34: χ2 = 67.0330、9.9836及49.3927, 均P<0.01). 在分化不良组与分化较好组血清AFP(-)HCC中表达差异性的比较中, Hep Par 1与CD34、CK20、CK19的表达均有统计学意义(P<0.01或0.05). 联合应用Hep Par 1、CD34对AFP(-)HCC与ICC、MAC的鉴别诊断评价准确度、灵敏度及特异度分别为: 90.7%、89.8%及93.3%.

结论: 联合应用Hep Par 1、CD34及Cytokeratin可提高血清AFP(-)HCC的诊断准确率及其与ICC、MAC的鉴别诊断准确率, 为临床治疗方案的选择与预测评估提供了病理依据.

关键词: 血清AFP阴性肝细胞肝癌; Hep Par 1; CD34; Cytokeratin; 免疫组织化学

引文著录: 张婷, 陈旭东, 何松, 王旗春. Hep Par 1、CD34及Cytokeratin在血清AFP阴性肝细胞癌诊断中的应用. 世界华人消化杂志 2009; 17(27): 2791-2797
Significance of hepatocyte paraffin-1, cluster of differentiation 34 and cytokeratin expression in the diagnosis of alpha-fetoprotein-negative hepatocellular carcinoma
Ting Zhang, Xu-Dong Chen, Song He, Qi-Chun Wang
Ting Zhang, Qi-Chun Wang, School of Medicine, Huzhou Teachers College, Huzhou 313000, Zhejiang Province, China
Xu-Dong Chen, Song He, Nantong Tumor Hospital, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
Correspondence to: Ting Zhang, School of Medicine, Huzhou Teachers College, 1 Xueshi Road, Huzhou 313000, Zhejiang Province, China. grape_chang@163.com
Received: July 1, 2009
Revised: August 30, 2009
Accepted: September 7, 2009
Published online: September 28, 2009

AIM: To investigate the significance of hepatocyte paraffin-1 (Hep Par-1), cluster of differentiation 34 (CD34) and cytokeratin (CK) expression in the diagnosis of alpha-fetoprotein-negative hepatocellular carcinoma (AFP(-)HCC) and in the differential diagnosis among AFP(-) HCC, intrahepatic cholangiocellular carcinoma (ICC) and metastatic adenocarcinoma (MAC).

METHODS: Paraffin-embedded surgical specimens were collected from 70 AFP(-)HCC patients, 6 ICC patients and 24 MAC patients at Nantong Tumor Hospital from 1989 to 2007. All specimens were stained immunohistochemically for Hep Par 1, CD34 and CK.

RESULTS: There were statistically significant differences in the positive expression rates of Hep Par 1 and CD34 in AFP(-)HCC, ICC and MAC (Hep Par 1: χ2 = 50.7937, 9.5745 and 37.4532, respectively; CD34: χ2 = 67.0330, 9.9836 and 49.3927, respectively; all P < 0.01). Significant differences were also noted in the positive expression rates of Hep Par 1, CD34, CK20 and CK19 between poorly and well differentiated AFP(-)HCC (all P < 0.01 or 0.05). The accuracy, sensitivity and specificity of combined immunohistochemical detection of Hep Par 1, CD34 and CK in the differential diagnosis among AFP(-) HCC, ICC and MAC were 90.7%, 89.8% and 93.3%, respectively.

CONCLUSION: Combined detection of Hep Par 1, CD34 and CK can improve the accuracy of diagnosis of AFP(-)HCC and of differential diagnosis among AFP(-)HCC, ICC and MAC.

Key Words: AFP-negative hepatocellular carcinoma; Hepatocyte paraffin-1; CD34; Cytokeratin; Immunohistochemistry


0 引言

当肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)血清AFP呈阴性(以AFP<10 μg/L为AFP(-)HCC)或病理类型不确定(如低分化或透明细胞型HCC)时, HCC的诊断及其与肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocellular carcinoma, ICC)、肝转移性腺癌(metastatic adenocarcinoma, MAC)等的鉴别诊断就成为外科病理诊断中的难题.

Hep Par 1是目前肝细胞分化标志物中较敏感和特异的标志物, 在HCC中呈胞质颗粒染色[1]. 但Hep Par 1在低分化HCC中表达率不高, 而低分化HCC更易与低分化ICC、MAC混淆. CD34在HCC中呈微血管均匀染色, 而在ICC和MAC中呈微血管不均染色[2]. Cytokeratin(CK)家族的CK7、CK19是ICC与HCC鉴别诊断的标志物[3-4].

本研究通过联合应用Hep Par 1、CD34及CK家族, 探讨这3类免疫组织化学标记在AFP(-)HCC及ICC、MAC鉴别诊断中的意义, 为AFP(-)HCC及ICC、MAC的临床治疗方案的选择和预测评估提供病理依据.

1 材料和方法
1.1 材料

选取南通市肿瘤医院1989-2007年手术切除的70例AFP(-)HCC、6例ICC及24例MAC(分别来源于6例肺腺癌、6例肾透明细胞癌、6例胃腺癌、6例卵巢透明细胞癌)的石蜡标本, 每例切4 μm切片, 分别作HE染色及免疫组织化学标记, 重新阅片观察.

1.2 方法

1.2.1 HE染色: 石蜡组织连续切片, 常规HE染色、封片. 结果判断: 根据病理分化分级(Edmondson-Steiner分级), 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ级. 将I、Ⅱ级作为分化较好组, 将Ⅲ、Ⅳ级作为分化不良组. AFP(-)HCC镜下组织学形态显示瘤细胞胞质有大量糖原或脂质积蓄呈透明状, 则诊断为AFP(-)HCC透明细胞亚型.

1.2.2 免疫组织化学染色: 免疫组织化学染色采用SP法. 实验操作按试剂盒说明进行, DAB显色, 以PBS代替第一抗作阴性对照, 用已知阳性切片作阳性对照. 即用型鼠单克隆抗体Hep Par 1、即用型鼠抗CD34 mAb、即用型兔抗人CK20 mAb、即用型兔抗人CK19多克隆抗体、即用型鼠抗人mAb CK7、SP即用型试剂盒和DAB显色试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供. 免疫组织化学结果判断: Hep Par 1在HCC中呈胞质均匀棕黄色颗粒染色; CD34在HCC中呈微血管长条状或分支状染色, 管壁纤细、管腔狭窄、分布均匀弥漫(如呈血管不均匀染色则判断为阴性); CK7、CK19、CK20呈胞质均匀棕黄色颗粒染色. 染色结果观察采用双盲法, 由两位病理科医生在不知病理分级与临床资料的情况下阅片, 每个切片观察5个视野(400倍)计算阳性细胞数, 计算总细胞数不少于1000个, 按阳性细胞所占百分数分为: 阳性细胞率<5%为阴性(-), >5%为阳性(+).

统计学处理 应用Stata 10.0统计软件对计数资料进行四格表χ2检验. 统计结果以P<0.05为有统计学差异, P<0.01为有显著统计学差异. 以准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Youden指数作为诊断价值的评价指标.

2 结果
2.1 Hep Par 1、CD34及CK在AFP(-)HCC中的表达

Hep Par 1呈胞质颗粒状染色(表达率82.9%); CD34呈血管均匀染色(表达率87.1%); CK家族多呈阴性(CK7、CK20、CK19的表达率分别为31.4%、10.0%和20.0%(表1-2, 图1).

表1 Hep Par 1、CD34及CK分别在AFP(-)HCC、ICC及MAC中的染色 (n = 100).
AFP(-)HCCICCMAC
肾透明细胞癌卵巢透明细胞癌胃腺癌肺腺癌
Hep Par 1胞质---膜浆+/-膜浆+/-
CD34血管均匀-----
CK7+/-胞质+/-胞质胞质胞质
CK20+/-+/-胞质---
CK19+/-胞质胞质-胞质胞质
图1
图1 Hep Par 1、CD34及CK19在AFP(-)HCC中的表达(SP×200). A: Hep Par 1呈颗粒状染色; B: CD34呈微血管长条状染色, 管壁纤细、管腔狭窄、弥漫分布; C: CK19呈阴性, 而周围正常胆管呈强阳性.
表2 Hep Par 1、CD34及CK分别在AFP(-)HCC、ICC及MAC中的表达 (n = 100).
AFP(-)HCC (n = 70)
ICC (n = 6)
MAC (n = 2400)
+(%)-χ2P+(%)-χ2P+(%)-χ2P
Hep Par 158(82.9)1250.7937<0.010(0)69.5745<0.012(8.3)2237.4532<0.01
CD3461(87.1)967.0330<0.010(0)69.9836<0.010(0)2449.3927<0.01
CK722(31.4)4819.9448<0.015(83.3)13.5815>0.0519(79.2)513.9846<0.01
CK207(10.0)630.2383>0.052(33.3)43.2520>0.052(8.3)220.2294>0.05
CK1914(20.0)5628.9289<0.015(83.3)15.8785<0.0518(75.0)619.5624<0.01

分化不良组与分化较好组比较, Hep Par 1的表达率显著降低(P<0.01), CD34的表达率有所降低(P<0.05); 而CK19、CK20的表达率有所升高(P<0.05, 表3).

表3 Hep Par 1、CD34、CK在不同病理分化分级AFP(-)HCC中的表达 (n = 70).
分化较好组
分化不良组
χ2P
Ⅰ(n = 9)
Ⅱ(n = 44)
Ⅰ、Ⅱ(n = 53)
Ⅲ(n = 11)
Ⅳ(n = 6)
Ⅲ、Ⅳ(n = 17)
+(%)-+(%)-+(%)-+(%)-+(%)-+(%)-
Hep Par 19(100)039(88.6)548(90.6)58(72.7)32(33.3)410(58.8)79.1305<0.01
CD349(100)040(90.9)449(92.5)47(63.6)45(83.3)112(70.6)55.4920<0.05
CK72(22.2)715(34.1)2917(32.1)363(27.3)82(33.3)45(29.4)120.0424>0.05
CK201(11.1)82(4.5)423(5.7)502(18.2)92(33.3)44(23.5)134.5665<0.05
CK191(11.1)86(13.6)387(13.2)464(36.4)73(50.0)37(41.2)106.2930<0.05

Hep Par 1、CD34在AFP(-)HCC透明细胞亚型中的表达率均较高(分别为87.0%和78.3%), 而CK家族表达率均较低(CK7、CK20及CK19分别为26.1%、4.4%和21.7%).

2.2 Hep Par 1、CD34及CK在ICC中的表达

Hep Par 1呈阴性; CD34部分呈血管不均染色; CK19、CK7呈胞质均匀棕黄色颗粒染色, CK20有部分表达(表1-2, 图2).

图2
图2 Hep Par 1、CD34及CK19在ICC中的表达(SP×200). A: Hep Par 1呈阴性; B: CD34血管染色呈干枝状、稀疏杂乱; C: CK19呈胞质均匀棕黄色颗粒染色.
2.3 Hep Par 1、CD34及CK在MAC中的表达

Hep Par 1在部分胃腺癌、肺腺癌中呈膜浆颗粒状染色. CK7、CK19在胃腺癌、肺腺癌中呈胞质颗粒状染色. CK19、CK20在肾透明细胞癌中呈胞质颗粒状染色. CD34在MAC中均呈血管不均染色(表1-2, 图3).

图3
图3 Hep Par 1、CD34及CK7在ICC中的表达(SP×200). A: Hep Par 1在肝转移性胃腺癌中的表达, 呈膜浆颗粒状染色; B: CD34肝转移性胃腺癌中血管染色呈干枝状、稀疏杂乱; C: CK7在肝转移性胃腺癌呈胞质均匀棕黄色颗粒染色.

此外, Hep Par 1、CD34在AFP(-)HCC透明细胞亚型与肾透明细胞癌、卵巢透明细胞癌的表达具有显著性差异(P<0.01, χ2值分别为19.1020, 16.3429).

联合应用Hep Par 1与CD34对AFP(-)HCC与ICC、MAC的灵敏度比单独使用单一标志物有所增高(表4).

表4 联合应用Hep Par 1与CD34对AFP(-)HCC与ICC、MAC的鉴别诊断评价 (%).
标志物准确度灵敏度特异度阳性预测值阴性预测值Youden指数
Hep Par 186.0(86/100)82.9(58/70)93.3(28/30)96.7(58/60)70.0(28/40)76.2
CD3491.0(91/100)87.1(61/70)100.0(30/30)100.0(61/61)76.9(30/39)87.1
Hep Par 1+CD3490.7(107/118)89.8(79/88)93.3(28/30)97.5(79/81)75.7(28/37)83.1
3 讨论

AFP是临床上诊断原发性HCC最常用的肿瘤标志物之一, 在肝癌普查、早期诊断和疗效判定等方面发挥着重要作用. 通过血清AFP检测HCC的诊断率约为70%, 但是仍有30%左右的HCC血清AFP为阴性[5]. 有研究发现AFP检测HCC的敏感性较低(70%左右), 特异性也较低(64%)[6], 因此单独应用AFP诊断HCC容易造成漏诊和误诊. 因此, 寻找阳性率高、特异性强的肝癌标志物是当前肝癌研究的重要课题.

Hep Par 1是1993年由美国Pittsburgh大学Wennerbery et al以石蜡包埋肝组织作为抗原而获得的一种单克隆抗体OCH1E5.2.10[7]. 文献[1]报道Hep Par 1对HCC特异性和敏感性比以往的抗体都高(Hep Par 1对HCC的敏感性为75%-99%), 被认为是HCC器官特异性抗体. Chu et al[8]报道Hep Par 1在HCC中的表达率为92%. 另有报道Hep Par 1免疫组织化学标记在HCC患者的骨髓中也有所表达[9]. 丛文铭 et al[10]报道Hep Par 1对HCC的敏感性为83.7%、特异性为96.7%, Hep Par 1除了在HCC中表达外, 还在50%的胃腺癌、胃和胆囊的肝样腺癌、内胚窦及肝母细胞瘤局灶性表达; 在结肠、肺、子宫颈、卵巢、胰腺和膀胱腺癌也可局灶表达, 而在肾透明细胞癌、乳腺癌、黑色素瘤和间皮瘤不表达. 我们的研究发现, Hep Par 1在部分胃腺癌、肺腺癌中也有表达, 表明Hep Par 1对于HCC的诊断并无绝对特异性. 这为Hep Par 1应用于HCC诊断带来了一定困难.

有研究发现Hep Par 1对于良恶性肝肿瘤是比较敏感和特异的指标, 在ICC中几乎不表达[8,11]. 但后来又有研究发现在某个患有HCC的特殊类型纤维板层癌与ICC的患者, 其HCC与ICC的成分都有Hep Par 1的表达[12]. 虽然Hep Par 1是鉴别HCC、ICC及MAC较好的指标, 但不是所有的Hep Par 1阳性的就是HCC或起源于肝细胞的肿瘤[8,13-16]. 所以单独的Hep Par 1的诊断显得非常单薄, 在本研究中我们对于HCC的诊断以及与ICC及MAC的鉴别诊断联合了其他的标记.

Hep Par 1的染色模式在分化较好的HCC和分化较差的HCC中差别很大, 在分化较好的HCC中可达到100%的肿瘤细胞染色, 而在部分分化较差的HCC中只有<5%的肿瘤细胞染色, 这一结果很容易引起假阴性[17], 在我们的研究中也有此发现.

CD34是血管源性肿瘤的特异性标志物之一, 属于HCC相对特异性抗体. 据报道CD34在HCC微血管中阳性表达, 呈特殊的长条状或分支状、管壁纤细、管腔狭窄、分布均匀弥漫, 而在ICC和MAC微血管中分布不均, 呈干枝状、稀疏杂乱[11,18]. 我们研究发现CD34这种特殊表达方式对于HCC的诊断具有一定的作用.

CK家族属于ICC及MAC相对特异性抗体, 有报道CK7、CK19是ICC与HCC鉴别诊断的标志物[3-4]. 我们研究发现CK在HCC中多呈阴性, 在部分ICC及MAC中有所表达, 这在HCC的鉴别诊断中发挥了重要的作用.

近年来国内外研究发现, 联合使用多种HCC敏感性、特异性强的多种标志物可显著增加HCC诊断与鉴别诊断正确率. 丛文铭 et al[10]报道了HCC免疫组织化学谱, 一线抗体由Hep Par 1和CD34组成, 二线抗体由pCEA和AFP组成; ICC的一线抗体为CK19, 二线抗体为CA19-9. 由3种一线抗体组合成肝癌的核心免疫组织化学谱, 酌情使用二线抗体, 可以较好地解决对HCC、ICC和MAC之间的免疫病理诊断和鉴别诊断.

本研究通过探讨Hep Par 1、CD34及CK免疫组织化学标记分别在AFP(-)HCC、ICC与MAC中的表达, 表明联合应用这些标记可提高AFP(-)HCC的诊断准确率及其与ICC、MAC的鉴别诊断准确率, 为临床治疗方案的选择和预测评估提供了病理依据.

同时联合应用Hep Par 1、CD34及CK免疫组织化学标记检测不同病理分化分级AFP(-)HCC, 为不同病理分化分级AFP(-)HCC选择最佳免疫组织化学标记组合. 我们的研究发现, AFP(-)HCC中Hep Par 1、CD34的表达率随着肿瘤分化程度降低而减低; 而CK19、CK20的表达率随着肿瘤分化程度的降低而升高, 提示联合应用这些标记可作为诊断AFP(-)HCC并确定其分化程度的一种重要手段.

在以往对于HCC鉴别诊断的研究中, ICC、MAC作为对照组多为随机选择的癌组织, 大多数根据HE形态即可明确ICC、MAC的诊断. 本研究特别选择了较易与HCC混淆的低分化ICC、低分化肺腺癌及胃腺癌、低分化肾及卵巢透明细胞癌等肝MAC作为对照组. 我们的研究发现, Hep Par 1在AFP(-)HCC中呈胞质颗粒状染色, 在部分MAC中(胃腺癌、肺腺癌)呈膜浆颗粒状染色, 在ICC、肾透明细胞癌、卵巢透明细胞癌中呈阴性; CD34在AFP(-)HCC中呈血管均匀染色, 在ICC、MAC中均呈血管不均染色; CK家族在AFP(-)HCC中多呈阴性, 在部分ICC及MAC中呈胞质颗粒状染色. 我们还发现, Hep Par 1、CD34在AFP(-)HCC透明细胞亚型与肾透明细胞癌、卵巢透明细胞癌的表达具有显著性差异(P<0.01), 这对于AFP(-)HCC透明细胞亚型与其他透明细胞肿瘤的鉴别具有重要的实用价值.

有研究发现, Hep Par 1、CD34的联合使用不仅可以鉴别HCC与ICC、MAC, 有时候Hep Par 1、CD34可以用于鉴别HCC与肝腺瘤样肿瘤[19].

我们的研究发现, 联合应用Hep Par 1与CD34对AFP(-)HCC与ICC、MAC的灵敏度比单独使用单一标志物有所增高. 而CK家族的加入使得ICC及MAC的诊断更具准确性.

除了联合应用各种免疫组织化学标记, 我们还需不断发现更多有价值的标志物开展进一步的研究. 近年来研究发现的某些标志物进一步提高了HCC的诊断正确率, 如Raf-1在早期肝癌中的高表达, 使其具备了良好的早期诊断能力[20], Aurora-B的检测可以作为肝癌的初步筛选指标[21].

评论
背景资料

血清甲胎蛋白(AFP)目前是诊断原发性肝细胞癌的首选血清标志物. 但近年来发现血清AFP阴性肝癌有增多趋势, 尚有其他肿瘤可出现血清AFP升高, 进一步增加了血清AFP阴性肝癌的漏诊率和误诊率. 选取HCC和ICC一线抗体并优化组合成诊断谱有助于提高血清AFP阴性肝癌诊断与鉴别诊断的正确率.

同行评议者

肖恩华, 教授, 中南大学湘雅二医院放射教研室.

研发前沿

HCC的早期诊断近年来成为临床医学研究热点之一. 联合应用特异性、敏感性及准确性更强的HCC血清学指标(如DcR3、leptin、VEGF等与AFP联用)、免疫组织化学诊断谱(Hep Par 1、CD34、CK家族、Raf-1等联用)及基因家族蛋白标志物(Aurora-B、survivin、RASSF1A、CYP3A5、Plk1等)等多种诊断技术已引起肿瘤学界的高度重视.

相关报道

丛文明 et al发现HCC的一线抗体由Hep Par 1和CD34组成, 二线抗体由pCEA和AFP组成; ICC的一线抗体为CK19, 二线抗体为CA19-9. 由3种一线抗体组合成肝癌的核心免疫组织化学谱, 酌情使用二线抗体, 可以较好地对HCC、ICC和肝MAC进行鉴别诊断. 而此诊断谱在血清AFP阴性HCC诊断及鉴别诊断中的作用则需要进一步研究.

创新盘点

本研究首次将免疫组织化学诊断谱用于血清AFP阴性HCC的诊断及其与ICC、肝MAC的鉴别诊断; 并发现此诊断谱有助于评估HCC分化程度.

应用要点

本研究选取HCC和ICC一线抗体组合成诊断谱, 综合比较了Hep Par 1、CD34及CK家族对血清AFP阴性HCC与ICC、肝MAC鉴别诊断的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Youden指数; 选择了较易与肝细胞癌混淆的低分化ICC、低分化肝MAC作为对照组, 具有较大的鉴别诊断实用价值.

同行评价

本文研究血清AFP呈阴性是HCC的阳性率高、特异性强的标志物, 对临床诊断有一定的意义.

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

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