修回日期: 2008-01-03
接受日期: 2008-01-15
在线出版日期: 2008-03-08
目的: 分析肝内胆管癌细胞系ICC-9810与正常肝细胞系L02的蛋白质表达差异, 筛选肝内胆管癌的潜在分子标志物.
方法: 应用表面增强激光解吸离子化(surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI)蛋白质芯片技术检测肝内胆管癌及正常肝细胞系的蛋白质谱. 用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据, 采用Proteinchip Software 3.0.2软件分析数据.
结果: IMAC3、WCX2两种蛋白芯片共捕获 376个蛋白峰, 发现27个差异蛋白. 与正常肝细胞系L02蛋白谱相比, 9个蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中高表达, 18个蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中低表达. 其中3767、7999、10555、12163、22066和26794 Da 6个差异蛋白可被WCX2和IMAC3芯片共同捕获.
结论: 肝内胆管癌与正常肝细胞存在差异蛋白表达, 这些差异蛋白为寻找肝肿瘤标志物, 了解肝内胆管癌的发病机制提供了重要线索.
引文著录: 刘博, 肖雪媛, 董家鸿, 何大澄, 黄志强. 肝内胆管癌细胞系ICC-9810与肝细胞系L02蛋白质组学的差异分析. 世界华人消化杂志 2008; 16(7): 759-762
Revised: January 3, 2008
Accepted: January 15, 2008
Published online: March 8, 2008
AIM: To analyze the differential expression of proteins in intrahepatic cholangio-carcinoma cell line ICC-9810 and normal liver cell line L02, and to screen the potential molecular markers for the diagnosis of intrahepatic cholangiocarcinoma.
METHODS: Surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI) mass spectrometry with ProteinChip IMAC3 and WCX2 was performed to compare the expressed proteins in intrahepatic cholangiocarcinoma cell line ICC-9810 and normal liver cell line L02. Protein profiling was examined with a PBSII-C ProteinChip reader and proteome data were analyzed using Proteinchip Software 3.0.2.
RESULTS: ProteinChip IMAC3 and WCX2 captured all the 376 protein peaks in ICC-9810 and L02 cell lines. Among the identified 27 differential proteins in ICC-9810 cell line, 9 showed a higher expression and 18 a lower expression as compared with L02 cell line. Six proteins, namely 3767, 7999, 10555, 12163, 22066 and 26794 Da, were conjointly detected by IMAC3 and WCX2 ProteinChip.
CONCLUSION: Expression of proteins is different in intrahepatic cholangiocarcinoma cells and normal liver cells. These differentially expressed proteins can be used as candidate biomarkers of intrahepatic cholangiocarcinoma and provide insights into the pathogenesis of intrahepatic cholangiocarcinoma.
- Citation: Liu B, Xiao XY, Dong JH, He DC, Huang ZQ. Differential expression of proteins in intrahepatic cholangiocarcinoma cell line ICC-9810 and liver cell line L02. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(7): 759-762
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v16/i7/759.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v16.i7.759
肿瘤细胞蛋白质组与正常细胞蛋白质组差异表达的研究是探索肿瘤发生机制、发现肿瘤标志物的有效途径. 肝内胆管癌约占肝癌的10%, 近年来在世界范围内肝内胆管癌发生率逐渐上升[1-3]. 我们利用蛋白质芯片技术分析了肝内胆管癌细胞系ICC-9810与正常肝细胞系L02的蛋白质谱, 对筛选肝内胆管癌的标志蛋白进行了初步分析.
肝内胆管癌细胞系ICC-9810由中国人民解放军总医院提供, 正常肝细胞系L02购自中国科学院上海细胞所. 胰蛋白酶、RPMI 1640购自Gibco公司, 乙氰、三氟乙酸、尿素、蛋白酶抑制剂、Hepes、Tri-HCl、CHAPS和OGP购自Sigma公司. IMAC3蛋白质芯片、WCX2蛋白质芯片和阴离子交换柱(Hyper QDF)、PBSII-C型蛋白质芯片阅读机和Proteinchip Software 3.0.2分析软件购自Ciphergen Biosystems公司.
肝内胆管癌细胞系ICC-9810和肝细胞系L02用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基培养. 用2.5 g/L胰蛋白酶消化、收集细胞, PBS洗涤, 加入细胞裂解液(8 mol/L Urea、40 g/L CHAPS、40 mmol/L Tris-HCl pH7.4, 1 mg/L的Leupeptin和Aprotinin、0.1 mmmol/L PMSF), 作用15 min, 20049 g离心30 min, 取少量上清用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度, 剩余上清-80 ℃分装冻存备用. 用1 mol/L Urea调节蛋白浓度至2 g/L. 取200 μL滴加到阴离子交换柱柱床上面, 1100 g/min振荡20 min. 阴离子交换柱采用梯度pH洗脱液(pH9, pH7, pH5, pH4, pH3和有机溶剂)洗脱, 以获得不同pH范围的流出液组分. 每组分别采用IMAC3和WCX2芯片检测, 每组同时在两个同种芯片上检测, 以避免同一种芯片之间的组间差异. 按照Ciphergen Biosystems公司蛋白质芯片操作指导进行IMAC3、WCX2蛋白芯片实验. 本课题设定有意义峰的信噪比为3, 差异蛋白定义为蛋白质峰强度相差1倍以上. 根据这一标准, PBSII-C型蛋白质芯片阅读机收集IMAC3、WCX2蛋白芯片数据, Ciphergen Proteinchip软件系统自动分析数据. 细胞培养在解放军总医院全军肝胆外科研究所进行, 蛋白质提取及检测在北京师范大学中国高校蛋白质组学研究院完成.
分析蛋白质芯片阅读机读取的IMAC3、WCX2蛋白芯片数据, IMAC3、WCX2两种蛋白芯片共捕获376个蛋白峰, 与正常肝细胞L02蛋白谱相比, 有27个蛋白质在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中出现明显的变化, 其中分子量为3639、3767、4422、5800、8716、9115、10127、10527和26794 Da的9个蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中高表达, 分子质量3782、4084、4843、5339、5362、5961、6056、6959、7027、7189、7999、8160、8400、10555、11643、12163、12207和22066 Da的18个蛋白在肝内胆管癌细胞中低表达. 在上述差异蛋白中有6个蛋白可被WCX2和IMAC3芯片共同捕获, 3767、26794 Da蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中高表达, 7999、10555、12163和22066 Da蛋白峰只在正常肝细胞系中高表达(图1, 图2).
胆管癌分肝内胆管癌和肝外胆管癌. 近年来肝内胆管癌发病率和死亡率有逐年增高的趋势. 肝内胆管癌病因不明, 研究显示与胆管结石、胆管炎、胆管囊肿、免疫性肠病、寄生虫感染、HBV及HCV病毒感染、肝硬化及饮酒等有关[4-9]. 肝内胆管癌早期诊断困难, 临床确诊患者多属晚期, 预后差. 周俭et al[10]分析31例肝内胆管癌临床资料, 5年生存率7%. 寻找敏感性高和特异性强的肝内胆管癌标志物, 力求做出早期诊断, 是提高肝内胆管癌生存率的关键.
蛋白质是基因组的表达产物, 能更直接地反映疾病在分子水平的变化. 国内外多家机构已经开始利用蛋白质组学寻找肿瘤特异蛋白, 并对各种蛋白进行分离鉴定[11-17]. Srisomsap et al[19]利用蛋白质组学技术分析了肝内胆管癌细胞系HuCCA-1、肝细胞癌细胞系HepG2和 HCC-S102及人乳腺癌细胞系MCF-7的蛋白质表达, 发现43个差异蛋白, 进一步研究表明CK7、CK19 和分子质量为32.9 kDa的三个蛋白质在肝内胆管癌细胞中特异表达, 对肝内胆管癌的诊断和与肝细胞癌的鉴别诊断具有重要意义. 周福平et al[20]利用显微切割技术研究了组织标本的肝内胆管癌和肝细胞癌蛋白质组, 通过质谱鉴定出28个有意义的蛋白, 20个蛋白仅在肝细胞癌表达或表达明显增高, 8个蛋白仅在肝内胆管癌中表达或者高表达. 免疫组化证实BK125H2.1在肝细胞癌中表达强阳性, 而肝内胆管癌中缺失表达. 分析认为BK125H2.1可能成为鉴别肝细胞癌与肝内胆管癌特异性的分子标记物.
最近研究证实, 肝干细胞定向分化为成熟肝细胞和胆管细胞, 异常分化为肝细胞癌和胆管细胞癌. 认为肝内胆管癌和正常肝细胞具有共同的母细胞来源, 只是异常分化和正常分化的结果[21]. 因此肝内胆管癌和正常肝细胞具有一定的可比性. 本研究以体外培养的肝内胆管癌细胞系ICC-9810和正常肝细胞系L02为实验材料, 采用SELDI蛋白质芯片技术比较肝内胆管癌细胞系ICC-9810和正常肝细胞系L02的蛋白表达, 发现有27个蛋白质在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中出现明显的变化, 9个蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中高表达, 18个蛋白低表达. 特别是WCX2和IMAC3芯片共同捕获的3767、26794、7999、10555、12163和22066 Da 6个蛋白, 进一步减少了单一芯片检查的误差, 增加了芯片检查的可信度, 获得的肿瘤细胞与正常细胞蛋白差异的生物学信息更准确. 我们已经开始对这些差异蛋白进行凝胶电泳分离、氨基酸测序和鉴定, 以确定差异蛋白的性质, 这些差异蛋白即是肝内胆管癌标志物的候选蛋白. 研究这些差异蛋白, 可以进一步了解正常肝细胞和肝脏肿瘤细胞的生物学特性, 就有可能筛选出肝内胆管癌的标志蛋白, 从而揭示肝内胆管癌发生发展的分子机制.
肝内胆管癌细胞系与肝细胞系之间的蛋白差异, 并不能全面反映肝内胆管癌和肝细胞之间的蛋白差异. 我们正在进行从肝癌患者血清或组织标本中筛选和鉴定肝癌的标志蛋白的研究.
肝内胆管癌占肝脏恶性肿瘤的10%-15%. 其发病率和病死率有逐年增高的趋势. 胆管癌5年生存率为7%, 根治术后5年生存率12.5%. 其早期诊断、鉴别诊断和术前定性诊断都相当困难. 临床确诊患者多属晚期, 且预后差. CA19-9是胆管癌常用的血清学指标, 80%以上患者CA19-9升高, 但特异性差, 绝大部分患者都是在晚期被诊断而丧失了手术的机会. 因此, 寻找新的血清标志分子对于胆管癌的早期诊断、术后复发的监测非常重要.
曹志成, 院士, 香港伊利沙伯医院临床肿瘤部, 肿瘤科研部
蛋白质组学的研究是继基因组学研究之后的又一个具有重大发展前景的科学领域, 其在实际应用方面也有极为广阔的前景.
Yu et al采用双向凝胶电泳技术比较了肝细胞癌细胞系BEL-7402和正常肝细胞系L02的蛋白质谱变化, 发现肝癌细胞谷光甘肽巯基转移酶蛋白比正常肝细胞高18倍, 而脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白只存在于正常肝细胞.
本文采用SELDI蛋白质芯片技术比较肝内胆管癌细胞系ICC-9810和正常肝细胞系L02的蛋白表达, 特别是WCX2和IMAC3两个芯片共同捕获的3767、26794、7999、10555、12163和22066 Da 6个蛋白, 进一步减少了单一芯片检查的误差, 增加了芯片检查的可信度, 获得的肿瘤细胞与正常细胞蛋白差异的生物学信息更准确.
研究差异蛋白可以进一步了解正常肝细胞和肝脏肿瘤细胞的生物学特性, 筛选出肝内胆管癌的可能标志蛋白, 从而揭示肝内胆管癌发生发展的分子机制.
本文行文简洁, 但研究内容稍嫌简单, 若能对其蛋白鉴定作更深入研究, 将对读者更有裨益.
编辑: 李军亮 电编: 何基才
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