实时荧光定量PCR检测IL-8 mRNA在大肠癌的表达

摘要

目的: 探讨大肠癌组织IL-8 mRNA表达及其临床意义.  

方法:  用实时荧光定量PCR检测56例大肠癌组织及癌旁正常组织IL-8 mRNA表达, 分析IL-8 mRNA表达与大肠癌临床病理因素之间的关系.

结果: 癌组织和癌旁正常组织IL-8 mRNA表达有显著差异(1.106±0.420 vs 0.792±0.374, P<0.05). 癌组织IL-8 mRNA表达与淋巴结转移、组织学类型、血管侵犯、肝转移及肿瘤病理分期密切相关, 与肿瘤部位、肿瘤大小、及患者的性别和年龄等无关.

结论:  IL-8高表达同大肠癌生物学行为密切相关, 可能与大肠癌的发生、发展及预后有关.

关键词: 大肠肿瘤; 白细胞介素8; 实时荧光定量聚合酶链式反应

Expression of interleukin-8 mRNA in patients with colorectal carcinoma detected by real-time quantitative PCR

Wen-Peng Zhou, Qing-Xia Fan, Kui-Sheng Fan, Rui-Lin Wang, Jin-Min Wu

Wen-Peng Zhou, Qing-Xia Fan, Kui-Sheng Fan, Rui-Lin Wang, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Jin-Min Wu, Oncology Center, Sir Run Run Shaw Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310016, Zhejiang Province, China

Correspondence to: Rui-Lin Wang, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 1 Jianshe Eastern Road, Zhengzhou 450052, Henan Province, China. zhwpeng@sohu.com

Received: July 19, 2007
Revised: December 28, 2007
Accepted: January 15, 2008
Published online: February 8, 2008

Abstract

AIM: To investigate the IL-8 mRNA expression in cancerous tissue from patients with colorectal carcinoma and to evaluate its clinic significance.

METHODS: Fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) was used to detect the IL-8 mRNA expression in cancerous tissue from 56 patients with colorectal carcinoma and to observe its relationship with pathologic parameters.

RESULTS: The expression of IL-8 mRNA was significantly higher in cancerous tissue from patients with colorectal carcinoma than in normal tissue (1.106 ± 0.420 vs 0.792 ± 0.374, P < 0.05). IL-8 mRNA expression was closely related with the pathologic parameters, such as presence of venous invasion, lymph node metastasis, histological type, liver metastasis and clinicopathological stage (Dukes) (P < 0.05). However, tumor site was not significantly related to the age and sex of the patients.

CONCLUSION: IL-8 mRNA expression is significantly correlated with the biological behavior of colorectal carcinoma. The high expression of IL-8 may be related with the occurrence and progress of colorectal cancer.

Key Words: Colorectal carcinoma; Interleukin-8; Fluorescent quantitative PCR

0 引言

趋化因子是一组对白细胞有趋化作用和激活功能的细胞因子. 近年来研究表明, 趋化因子与肿瘤生长和转移有密切关系, 其中研究较为深入的是白介素-8(IL-8). 在许多肿瘤组织中均可检测到IL-8蛋白质分泌及其mRNA表达, 而在其相应正常组织IL-8不表达或呈低表达状态, 说明IL-8与肿瘤发生、发展有关. 因此, 我们应用实时荧光定量PCR法检测大肠癌患者癌组织IL-8 mRNA表达, 并分析其与临床病理因素之间关系.

1 材料和方法

1.1 材料

2002-07/2004-07浙江大学附属邵逸夫医院肿瘤外科的住院大肠癌患者56例. 男33例, 女23例. 年龄31-85(中位年龄55)岁. 所有标本均经过病理证实. 其中, 结肠癌22例, 直肠癌34 例. 组织学类型: 乳头状腺癌7例, 管状腺癌44 例, 黏液腺癌5例. 我们将乳头状腺癌和高、中分化腺癌定为分化好型, 将低分化及黏液腺癌定为分化差型. 临床病理分期按Dukes分期. 全部病例术前均未接受化疗及放疗. FQD-33A荧光定量PCR仪由杭州大和热磁电力有限公司提供. 总RNA抽提试剂盒和M-MuLV逆转录酶购自Promega公司. 逆转录实时荧光定量PCR试剂购自Roche公司.

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成: 引物和探针在GenBank查到基因序列, 使用软件Primer-Express2.0进行设计. IL-8上游引物: 5'-AGAGTGGACCACACTGCGC-3', 下游引物: 3'-ACATCCCAACGGTCTACGTTA-5', 扩增片段为251 bp; GAPDH上游引物为5'-GAAGATGGTGATGGGATTT-3', 下游引物为5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3', 扩增产物长226 bp. 上述引物均由上海博亚生物技术服务公司合成.

1.2.2 标本制备、RNA提取和cDNA合成: 标本采集后迅速放至液氮中冷冻, -80 ℃保存. 使用TRIzol RNA提取液, 按照其说明书对大肠癌组织和癌旁正常组织提取总RNA, 通过甲醛变性凝胶电泳定性和紫外分光光度仪定量. 取总RNA 1 µg, 进行逆转录, 按照说明书进行cDNA合成, 所得cDNA置于-20 ℃保存. GAPDH和IL-8 mRNA的PCR反应: 反应体系为25 µL, l0×PCR Buffer 2.5 µL, 25 mmol/L MgCl₂ 1.5 µL, l0 mmol/L dNTP 0.5 µL, l0 nmol/L Primer 1 µL/L, l nmol/L probe 2.5 µL, 5 µL/L Taq 0.25 µL, cDNA 2.5 µL, 无菌双蒸水15 µL, 反应条件: 94 ℃变性5 min, 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 45 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环, 循环结束后72 ℃延伸10 min, 每个标准品和标本均作复管PCR反应.

1.2.3 PCR产物定量的校正和判定分析: 采用 GAPDH作为内参照. IL-8 mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数. 用GAPDH的拷贝数作为校正基数, 即目的基因mRNA精确含量 = 目的基因CT值/内参照GAPDH CT值, 以此比值作统计处理. 根据FQ-PCR原理, 被激发的荧光信号达到一定阈值后被荧光探头采集, 最后将其转换成CT值, 该数值与扩增片段的实际拷贝数呈反比, 即CT值越低, 实际拷贝数含量越高.

统计学处理 各数据均以mean±SD表示, 进行配对t检验, 应用SPSS11.0统计软件对所得数据进行统计学处理, 以P<0.05为有显著性差异.

2 结果

2.1 IL-8在大肠癌组织和癌旁正常组织中的表达

大肠癌癌旁正常组织和大肠癌组织均表达IL-8 mRNA, 其表达水平分别为1.306±0.448和1.028±0.456, 大肠癌组织IL-8 mRNA表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05).

2.2 癌组织IL-8表达与大肠癌临床病理指标的关系

IL-8 mRNA在乳头状腺癌和管状腺癌组织中的表达明显高于黏液腺癌组织(1.106±0.420 vs 0.792±0.374, P<0.05). 在有淋巴结转移者中的表达明显低于无淋巴结转移者(P<0.05). 肝脏转移者IL-8 mRNA表达低于无肝脏转移者(0.756±0.328 vs 1.103±0.424, P<0.05). 按大肠癌Dukes分期标准, 本组A期和B期20例, C期和D期36例. C、D期IL-8 mRNA表达平均指数为0.891±0.349, A、B期为1.223±0.449, 前者IL-8 mRNA表达明显低于后者(P<0.05, 表1).

表1 IL-8 mRNA与大肠癌临床病理指标.

	n	IL-8 mRNA
性别
男	33	0.997±0.390
女	23	1.072±0.441
年龄
>55	39	1.073±0.426
<55	17	0.926±0.360
肿瘤大小(cm)
>5	27	0.921±0.353
<5	29	1.143±0.436
肿瘤部位
结肠	22	0.945±0.385
直肠	34	1.081±0.385
组织类型
高分化	42	1.106±0.420
低分化	14	0.792±0.374a
血管侵犯
有	27	0.866±0.379
无	29	1.179±0.439a
淋巴结转移
有	31	0.889±0.347
无	25	1.202±0.467a
肝转移
有	12	0.756±0.328
无	44	1.103±0.424a
Dukes分期
A/B	20	1.223±0.449
C/D	36	0.891±0.349a

^aP<0.05.

3 讨论

浸润、转移及复发是肿瘤生物学主要特性, 具有重要的临床意义, 因而备受关注. 而血管形成在肿瘤浸润、复发及转移过程中有非常重要的作用. 肿瘤的持续生长必须依赖新生血管的形成, 如果肿瘤不能血管化, 生长至2-3 mm便发生退化. 血管化不仅能通过"灌注"效应促进肿瘤生长, 并为肿瘤细胞进入血液循环和转移提供可能, 在肿瘤形成中起着重要的作用[1]. 目前的研究显示, IL-8参与肿瘤血管形成, IL-8与肿瘤的侵润、转移密切相关[2-5]. Lee et al[6]检测35例胃癌患者癌组织和癌旁正常组织中的IL-8表达, 癌组织中IL-8表达显著高于癌旁正常组织, 随着病理分期的升高, IL-8的表达也逐步升高, 二者有显著相关性. 同时IL-8的表达与病理分型也有显著的相关性, 而IL-8的高表达与胃癌患者的生存时间有显著负相关性, 这表明IL-8的表达在预测胃癌癌变过程中是非常重要的有效的指标. 研究者在肺癌[7,8]和卵巢癌[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]等也得出了类似的结果, 提示IL-8参与肿瘤的发生和发展. 本研究显示, 大肠癌患者癌组织IL-8 mRNA表达强度明显高于正常组织, 而且随着大肠癌临床病理分期的升高而明显上升, 呈显著正相关, 癌组织IL-8 mRNA的高表达与血管侵犯、淋巴结转移和肝脏转移呈显著正相关, 提示IL-8参与大肠癌的浸润和转移.

研究表明IL-8除参与肿瘤血管形成外, 还通过阻滞细胞凋亡[12]、促进细胞和细胞及细胞和基质间黏附[13]、自分泌[14,15]、上调基质金属蛋白酶[16]及通过调节EGFR[3]等作用而参与肿瘤的发生发展. 由于IL-8与血管形成及肿瘤生长密切相关, Inoue et al[17]用IL-8反义cDNA全序列抑制肿瘤组织血管形成和肿瘤转移, 而Hjortoe et al[18]用乳腺癌细胞系MDA-MB-231接种动物, 对产生肿瘤的动物分别用抗IL-8抗体和对照抗体处理, 结果表明, 与对照组相比, 抗IL-8抗体处理的肿瘤生长明显延缓, 出现转移时间明显延长. Zhang et al[19]研究前列腺癌细胞PC-3MM2时也有类似发现. 提示IL-8可成为抗肿瘤治疗的一个新的靶点.

评论

背景资料

近年来研究表明, 趋化因子与肿瘤生长和转移有密切关系, 因此, 本文应用实时荧光定量PCR法检测大肠癌患者癌组织IL-8 mRNA表达, 并分析其与临床病理因素之间关系.

同行评议者

高泽立, 副教授, 上海交通大学医学院附属第三人民医院感染科

研发前沿

血管化不仅能通过"灌注"效应促进肿瘤生长, 而且能为肿瘤细胞进入血液循环和转移提供可能, 在肿瘤形成中起重要的作用. 目前的研究显示, IL-8参与肿瘤血管形成, IL-8与肿瘤的侵润、转移密切相关.

创新盘点

本文对IL-8 mR-NA与大肠癌的研究提供了一定的理论基础.

同行评价

本文所用方法先进, 数据可靠, 引用参考文献得当.

备注

编辑: 程剑侠 电编: 郭海丽

参考文献

1.	Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 1996;86:353-364.  [PubMed]  [DOI]

2.

Murphy C, McGurk M, Pettigrew J, Santinelli A, Mazzucchelli R, Johnston PG, Montironi R, Waugh DJ. Nonapical and cytoplasmic expression of interleukin-8, CXCR1, and CXCR2 correlates with cell proliferation and microvessel density in prostate cancer. Clin Cancer Res. 2005;11:4117-4127.  [PubMed]  [DOI]

3.	Luppi F, Longo AM, de Boer WI, Rabe KF, Hiemstra PS. Interleukin-8 stimulates cell proliferation in non-small cell lung cancer through epidermal growth factor receptor transactivation. Lung Cancer. 2007;56:25-33.  [PubMed]  [DOI]

4.	Takehara H, Iwamoto J, Mizokami Y, Takahashi K, Ootubo T, Miura S, Narasaka T, Takeyama H, Omata T, Shimokobe K. Involvement of cyclooxygenase-2--prostaglandin E2 pathway in interleukin-8 production in gastric cancer cells. Dig Dis Sci. 2006;51:2188-2197.  [PubMed]  [DOI]

5.

Trevino JG, Gray MJ, Nawrocki ST, Summy JM, Lesslie DP, Evans DB, Sawyer TK, Shakespeare WC, Watowich SS, Chiao PJ. Src activation of Stat3 is an independent requirement from NF-kappaB activation for constitutive IL-8 expression in human pancreatic adenocarcinoma cells. Angiogenesis. 2006;9:101-110.  [PubMed]  [DOI]

6.	Lee KH, Bae SH, Lee JL, Hyun MS, Kim SH, Song SK, Kim HS. Relationship between urokinase-type plasminogen receptor, interleukin-8 gene expression and clinicopathological features in gastric cancer. Oncology. 2004;66:210-217.  [PubMed]  [DOI]

7.	Tas F, Duranyildiz D, Oguz H, Camlica H, Yasasever V, Topuz E. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin-8 (IL-8) levels in small cell lung cancer. Cancer Invest. 2006;24:492-496.  [PubMed]  [DOI]

8.	Henriquet C, Gougat C, Combes A, Lazennec G, Mathieu M. Differential regulation of RANTES and IL-8 expression in lung adenocarcinoma cells. Lung Cancer. 2007;56:167-174.  [PubMed]  [DOI]

9.	Lokshin AE, Winans M, Landsittel D, Marrangoni AM, Velikokhatnaya L, Modugno F, Nolen BM, Gorelik E. Circulating IL-8 and anti-IL-8 autoantibody in patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 2006;102:244-251.  [PubMed]  [DOI]

10.	Derin D, Soydinc HO, Guney N, Tas F, Camlica H, Duranyildiz D, Yasasever V, Topuz E. Serum IL-8 and IL-12 levels in breast cancer. Med Oncol. 2007;24:163-168.  [PubMed]  [DOI]

11.	Lin Q, Huang MS, Hu B, Dong M, Wen JY, Wu XY. [Serum levels of macrophage migration inhibitory factor and interleukin-8 in hepatocellular carcinoma patients: their correlations with tumor progression and prognosis]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2007;15:463-464.  [PubMed]  [DOI]

12.	Abdollahi T, Robertson NM, Abdollahi A, Litwack G. Identification of interleukin 8 as an inhibitor of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in the ovarian carcinoma cell line OVCAR3. Cancer Res. 2003;63:4521-4526.  [PubMed]  [DOI]

13.	Barshishat M, Ariel A, Cahalon L, Chowers Y, Lider O, Schwartz B. TNFalpha and IL-8 regulate the expression and function of CD44 variant proteins in human colon carcinoma cells. Clin Exp Metastasis. 2002;19:327-337.  [PubMed]  [DOI]

14.	Huang J, Yao JL, Zhang L, Bourne PA, Quinn AM, di Sant'Agnese PA, Reeder JE. Differential expression of interleukin-8 and its receptors in the neuroendocrine and non-neuroendocrine compartments of prostate cancer. Am J Pathol. 2005;166:1807-1815.  [PubMed]  [DOI]

15.	Kamohara H, Takahashi M, Ishiko T, Ogawa M, Baba H. Induction of interleukin-8 (CXCL-8) by tumor necrosis factor-alpha and leukemia inhibitory factor in pancreatic carcinoma cells: Impact of CXCL-8 as an autocrine growth factor. Int J Oncol. 2007;31:627-632.  [PubMed]  [DOI]

16.	Watanabe H, Iwase M, Ohashi M, Nagumo M. Role of interleukin-8 secreted from human oral squamous cell carcinoma cell lines. Oral Oncol. 2002;38:670-679.  [PubMed]  [DOI]

17.	Inoue K, Slaton JW, Kim SJ, Perrotte P, Eve BY, Bar-Eli M, Radinsky R, Dinney CP. Interleukin 8 expression regulates tumorigenicity and metastasis in human bladder cancer. Cancer Res. 2000;60:2290-2299.  [PubMed]  [DOI]

18.	Hjortoe GM, Petersen LC, Albrektsen T, Sorensen BB, Norby PL, Mandal SK, Pendurthi UR, Rao LV. Tissue factor-factor VIIa-specific up-regulation of IL-8 expression in MDA-MB-231 cells is mediated by PAR-2 and results in increased cell migration. Blood. 2004;103:3029-3037.  [PubMed]  [DOI]

19.	Zhang F, Lee J, Lu S, Pettaway CA, Dong Z. Blockade of transforming growth factor-beta signaling suppresses progression of androgen-independent human prostate cancer in nude mice. Clin Cancer Res. 2005;11:4512-4520.  [PubMed]  [DOI]