修回日期: 2008-11-18
接受日期: 2008-11-24
在线出版日期: 2008-12-18
目的: 研究人胰腺癌组织中Midkine(MK)和Caspase-3蛋白的表达特点, 探讨其表达与胰腺癌细胞凋亡的关系.
方法: 收集人胰腺癌组织标本49例, 免疫组织化学SP法检测MK和Caspase-3蛋白的表达, 原位凋亡检测试剂盒辣根过氧化物酶(TUNEL)检测细胞凋亡指数. 以同期15例正常胰腺组织标本为对照.
结果: MK蛋白、Caspase-3蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率高于正常胰腺组织(71.4% vs 0, P<0.01; 77.6% vs 46.7%, P<0.05), MK蛋白表达与胰腺癌组织学分化、临床分期和淋巴转移相关(P<0.05), Caspase-3蛋白表达仅与组织学分化有关; 胰腺癌组织标本中, MK阳性表达组凋亡指数显著低于MK阴性表达组(5.13±2.69 vs 7.93±6.65, P<0.05); 胰腺癌组织中MK与Caspase-3蛋白的表达呈负相关(r = -0.34, P<0.05).
结论: MK和Caspase-3参与了胰腺癌的发生发展, MK在胰腺癌组织中的高表达具有抑制细胞凋亡的生物学功能, 其作用机制可能是通过抑制Caspase-3的活性.
引文著录: 龙辉, 吴清明, 马松林, 刘群, 张金华, 陈新胜, 汪得胜, 赵丽莎, 李欢. Midkine和Caspase-3在胰腺癌中的表达与细胞凋亡的关系. 世界华人消化杂志 2008; 16(35): 4015-4019
Revised: November 18, 2008
Accepted: November 24, 2008
Published online: December 18, 2008
AIM: To study the expression of Midkine (MK) protein and Caspase-3 protein in human pancreatic cancer and to investigate their association with cell apoptosis.
METHODS: The immunohistochemical staining (SP) method was used to detect the expression of MK protein and Caspase-3 in 49 cases of pancreatic cancer tissues and 15 cases of normal pancreatic tissues. The TUNEL method was used to detect apoptotic index in pancreatic cancer tissues.
RESULTS: The positive rates of MK protein and Caspase-3 protein were significantly higher in pancreatic cancer tissue than in normal pancreatic tissue (71.4% vs 0, P < 0.01; 77.6% vs 46.7%, P < 0.05). Expression of MK protein was correlated with tumor's histological grading, clinical stages and lymph node metastasis (P < 0.05) while expression of Caspase-3 protein was only correlated with tumor's histological grading (P < 0.05). The mean apoptotic index was significantly lower in MK positive expression group than in MK negative expression group (5.13 ± 2.69 vs 7.93 ± 6.65, P < 0.05). The expression level of MK protein had a negative correlation with Caspase-3 (r = -0.34, P < 0.05).
CONCLUSION: The gene of Midkine and Caspase-3 participate in development of pancreatic cancer, and high express of Midkine has a biological function of inhibiting cell apoptosis possibly through suppressing cell activity of Caspase-3 protein.
- Citation: Long H, Wu QM, Ma SL, Liu Q, Zhang JH, Chen XS, Wang DS, Zhao LS, Li H. Expression of Midkine and Caspase-3 and their relationship with apoptosis in pancreatic cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(35): 4015-4019
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v16/i35/4015.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v16.i35.4015
细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式. 正常状态下细胞凋亡与细胞增殖维持着动态平衡, 对维护机体内环境的稳定具有至关重要的作用. 大量体内外相关研究表明, 肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的凋亡现象共存, 与细胞的凋亡速度密切相关, 促进细胞凋亡在抑制肿瘤发生、发展中的作用日益为人们所重视[1]. Midkine(MK)是一种新的肝素结合性生长分化因子, 近年来被越来越多的研究证实其在多种恶性肿瘤中高度表达, 由于其独特的结构、特殊的组织分布与抗凋亡、促血管新生等生物学功能, 引起了肿瘤研究工作者的浓厚兴趣, 使其成为目前研究的热点之一[2], 在胰腺癌中也证实MK的过表达[3], 但具体的生物学功能及作用机制尚不清楚. Caspase-3是凋亡信号传导通路中的重要执行分子, 其表达具有反映凋亡启动因素存在和凋亡发生的双重生物学效应, 其激活后导致细胞的不可逆性凋亡[4].
本实验采用免疫组织化学SP法检测胰腺癌组织中MK和Caspase-3蛋白的表达情况, 并用原位凋亡检测TUNEL法检测胰腺癌组织中的细胞凋亡, 拟探讨MK和Caspase-3蛋白在胰腺癌组织中的表达特点及其与细胞凋亡的关系.
收集武汉同济医院及武汉科技大学附属天佑医院2000-01/2007-10外科手术切除的胰腺癌标本49例, 患者术前均未行放疗及化疗, 术后经组织病理学证实为胰腺腺癌. 其中男30例, 女19例, 年龄21-75岁; 组织学分级高中分化30例, 低分化19例; 伴有淋巴结转移31例, 无淋巴结转移18例; 按TNM分期标准Ⅰ、Ⅱ期21例, Ⅲ、Ⅳ期28例. 另取同期病理证实的15例正常胰腺组织作为对照, 主要来自尸检标本. 所有标本常规石蜡包埋, 4 μm连续切片.
兔抗人MK、Caspase-3多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司, 工作浓度1:50; 兔抗SP试剂盒、DAB显色试剂盒、原位凋亡检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司.
1.2.1 检测: 免疫组化实验步骤按SP试剂盒说明书进行, 以微波枸橼酸盐进行抗原热修复, DAB显色, 苏木素复染. 用已知的MK和Ki67阳性片作为阳性对照, PBS代替一抗作为阴性对照. TUNEL法检测凋亡按试剂盒说明进行, DAB显色, 苏木素复染.
1.2.2 结果判定: MK及Caspase-3蛋白的表达以细胞胞质中出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞, 计算阳性细胞百分率, 阳性细胞数<5%为阴性(-), ≥5%为阳性(+). 凋亡细胞以细胞胞核被染成棕黄色为阳性细胞, 高倍镜下随机计数至少10个视野1000个细胞, 计算凋亡指数(Apoptosis index, AI) = 阳性细胞总数/1000×100%.
统计学处理 MK及Caspase-3蛋白的表达用阳性例数计数表示, 凋亡指数用mean±SD表示, 所有数据均用SPSS12.0统计软件包进行统计学处理, 结果分析用χ2检验或Fisher精确概率法及相关性分析, 两组间AI分析用t检验. 以P<0.05为有显著统计学意义.
49例胰腺癌组织中MK蛋白阳性表达率为71.4%, 其阳性表达主要定位于肿瘤细胞胞质, 细胞外间质中血管密集处血管内皮细胞也有阳性染色(图1). MK蛋白在胰腺癌组织中的表达与性别、年龄无关, 组织学分级低分化者MK表达阳性率高于高中分化者(P<0.05), TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者高于Ⅰ、Ⅱ期者(P<0.05), 有淋巴转移者高于无淋巴转移者(P<0.05, 表1) .15例正常胰腺组织中均未见MK阳性表达, 与胰腺癌组织组织统计学差异性极其显著(P<0.01).
| 分组 | n | Midkine | 细胞凋亡 | ||
| 阳性数 | P值 | AI | P值 | ||
| 性别 | |||||
| 男 | 30 | 21 | 0.781 | 5.56±3.94 | 0.440 |
| 女 | 19 | 14 | 6.51±4.54 | ||
| 年龄 | |||||
| ≥50 | 37 | 27 | 0.958 | 5.97±4.23 | 0.850 |
| <50 | 12 | 8 | 5.86±3.57 | ||
| 组织学分级 | |||||
| 高中分化 | 30 | 18 | 0.026 | 7.04±4.77 | 0.023 |
| 低分化 | 19 | 17 | 4.17±2.99 | ||
| 临床分期 | |||||
| Ⅰ+Ⅱ期 | 21 | 11 | 0.011 | 7.83±4.91 | 0.008 |
| Ⅲ+Ⅳ期 | 28 | 24 | 4.51±3.54 | ||
| 淋巴转移 | |||||
| 有 | 31 | 26 | 0.011 | 4.73±3.79 | 0.011 |
| 无 | 18 | 9 | 7.99±4.79 | ||
49例胰腺癌组织中有38例Caspase-3蛋白阳性表达率为77.6%(38/49). 胰腺癌组织中Caspase-3蛋白的阳性表达主要定位于细胞胞质(图2). Caspase-3蛋白在胰腺癌组织中的表达与性别、年龄无关, 组织学分级低分化者低于高中分化者(P<0.01), TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者与Ⅰ、Ⅱ期者无显著统计学差异性, 有淋巴转移者与无淋巴转移者也无显著统计学差异性. Caspase-3蛋白在15例正常胰腺组织中有7例阳性表达, 阳性率为46.7%(7/15), 低于胰腺癌组织(P<0.05).
15例正常胰腺组织中细胞凋亡程度较低, 平均凋亡指数为0.63±0.21. 所有胰腺癌组织标本均可检测到凋亡细胞(图3), 49例胰腺癌组织平均凋亡指数为5.93±4.18. 胰腺癌组织中的凋亡指数高于正常胰腺组织, 两者有显著统计学差异性(P<0.01).
胰腺癌组织标本中, 凋亡指数与性别、年龄无关(P>0.05), AI有随肿瘤进展而降低的趋势, 组织学分级高中分化者AI大于低分化者(P<0.05), TNM分期Ⅰ、Ⅱ期者AI大于Ⅲ、Ⅳ期者(P<0.01), 无淋巴转移者AI大于有淋巴转移者(P<0.05, 表1).
细胞凋亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD), 是一种基因控制的细胞自主性死亡过程, 是维持机体内环境稳定的重要机制之一. 他是多细胞生物体内的一个重要生命现象, 既出现在个体发育过程中, 也出现在正常生理状态或疾病中, 既在体内发生, 也出现在体外培养物中. 细胞凋亡在胚胎发育、神经系统的功能完善以及免疫功能调节等方面具有关键性的作用. 细胞凋亡功能亢进与组织损伤和器官功能衰竭的发病密切相关, 而细胞凋亡功能的抑制将导致肿瘤的发生及免疫功能的异常[1].
细胞凋亡的机制尚不完全清楚. 但在过去的几年里, 凋亡的基础研究已取得了巨大进展, 认为细胞内所发生的与凋亡有关的一系列有序的级联反应, 关键是激活了一组被称为Caspase的蛋白酶[5].
Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族, 其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用. 他们通过切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、关闭DNA复制核修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等途径促使细胞凋亡. 通过生物化学和遗传学研究表明, Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡发生过程中的各个阶段都发挥重要作用. 在细胞凋亡过程中根据Caspase的作用不同, 研究者将Caspase分为始动Caspase和执行Caspase, 前者包括Caspase-8、Caspase-9、 Caspase-10, 后者包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7. 其中Caspase-3是已知的该家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一, 许多的细胞外凋亡信号使之激活, 使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白酶失活, 引发细胞凋亡. 目前相关研究认为Caspase-3与胰腺癌细胞凋亡也是密切相关的[6-8].
MK表达于多种恶性肿瘤中, 在消化系统肝癌、胆囊癌、食管癌、胃癌、大肠癌均有MK过表达报导[9-10], 但目前有关MK基因在胰腺癌中表达及其生物学功能的报道尚少. 从本实验研究结果我们看到MK蛋白在正常胰腺组织中不表达, 而在胰腺癌组织中呈高表达71.4%(35/49), 且MK蛋白的表达与胰腺癌组织学分级、临床分期、淋巴转移密切相关, 在胰腺癌早期就存在MK的过表达, 但随肿瘤进展其表达增高. 提示我们MK不仅参与了胰腺癌的发生, 且与胰腺癌的进展密切相关. 而其在正常胰腺组织中完全不表达, 提示MK蛋白不仅可望成为胰腺癌早期诊断的标志物之一, 并可作为评估胰腺癌手术治疗后疗效及判断预后的一个辅助指标.
在分析Caspase-3表达特点时发现, Caspase-3在正常胰腺组织和胰腺癌组织标本中均高表达, 但在胰腺癌组织中表达更高, 其表达与组织学分级相关, 低分化者低于高中分化者(P<0.05), 提示在肿瘤分化的不同阶段肿瘤凋亡蛋白Caspase-3的表达程度亦不同.
有意义的是, 本实验中我们发现, 胰腺癌组织中细胞凋亡明显强于正常胰腺组织细胞凋亡, 但在胰腺癌进展过程中, 细胞凋亡有随肿瘤进展而降低的趋势, 高中分化者大于低分化者(P<0.05), TNM分期Ⅰ、Ⅱ期者大于Ⅲ、Ⅳ期者(P<0.01), 无淋巴转移者大于有淋巴转移者(P<0.05). 提示我们在胰腺癌发生发展过程中, 细胞凋亡被抑制起着非常重要的作用: 在胰腺癌早期, 机体存在较高的细胞凋亡, 这种较高的细胞凋亡可能是机体的一种防御性反应来清除病变细胞. 但随着肿瘤进展, 由于各种因素导致凋亡受抑, 肿瘤细胞呈无限制增殖状态从而使胰腺癌病变不断进展恶化.
本实验在研究MK蛋白的表达与肿瘤细胞凋亡关系时发现: 35例MK阳性表达组中平均凋亡指数为5.13±2.69, 显著低于MK阴性表达组平均凋亡指数7.93±6.65, 差异具有显著性(P<0.05), 提示MK蛋白在胰腺癌组织中的高表达可能抑制细胞凋亡.
目前已有相关的实验在研究MK抑制细胞凋亡的具体途径. Salama et al[11]发现MK可与层黏蛋白连接蛋白前体结合, 之后转移至细胞核发挥作用; Stoica et al[12]证实MK可紧密连接于细胞表面受体间变性淋巴瘤激酶(ALK), 并进一步激活磷脂酰肌醇3激酶和丝裂素活化蛋白激酶转导途径; Shibata et al[13]发现外源性MK通过低密度脂蛋白受体相关蛋白结合后, 经胞饮作用进入细胞膜后转移至核内发挥其生理、病理作用, 此过程可能与MK抗凋亡作用相关. 确切的生物学机制仍有待进一步实验研究.
从我们实验结果中进一步分析MK和Caspase-3蛋白在胰腺癌组织中表达与细胞凋亡关系时发现, 35例MK蛋白阳性表达组Caspase-3蛋白阳性率为68.6%, 14例MK蛋白阴性表达组中有全部Caspase-3蛋白阳性表达, 阳性率为100%, 两者差异有显著性且存在负相关(r = -0.34, P<0.05). 即MK蛋白在胰腺癌组织中的高表达与Caspase-3蛋白的表达负相关, 提示MK可能是通过调控Caspase-3的表达从而实现其部分生物学功能的. 而Caspase-3是已知的执行细胞凋亡的关键酶之一, 故进一步提示我们MK可能是通过抑制Caspase-3的活性从而抑制胰腺癌细胞凋亡. 这对于更深层次的研究MK在胰腺癌中过表达的生物学意义很有帮助.
由于胰腺癌早期诊断率低, 确诊时往往已属晚期, 因此根治手术机会较小, 且胰腺癌对放化疗均不敏感, 故基因治疗成为目前胰腺癌治疗研究的热点之一. 胰腺癌基因治疗的关键是由载体将目的基因安全、特异、高效地转染至靶细胞, 目前多采用病毒及脂质体方法, 但转染效率较低[14]. 近年来MK基因已成为抗肿瘤治疗的研究方向之一[15-16]. Takei et al在体外和动物实验中设计MK反义寡脱氧核糖核苷酸用于直肠癌等肿瘤基因治疗, 实验结果显示能够抑制肿瘤细胞生长[17-18]. Inoh et al[19]试验将阿霉素结合的抗MK mAb用于抗肿瘤治疗. 本研究发现MK在胰腺癌组织中高表达而不表达于相应正常胰腺组织, 且MK在胰腺癌组织中可能具有的抑凋亡作用, 并与Caspase-3的表达具有负相关关系, 从而提示我们提示通过基因或药物方法特异性阻断MK的表达, 和(或)抑制Caspase-3活性从而阻断其作用途径, 可能达到促进胰腺癌肿瘤细胞凋亡的目的从而使MK基因成为胰腺癌基因治疗的新靶点和基因方法, 这也是我们下一步实验的目的.
胰腺癌因恶性程度高、治疗困难、预后差, 仍是肿瘤病学的一大挑战. 研究并找到一种与胰腺癌发生发展密切相关的分子生物学标志物, 使其能够运用于筛查、早期诊断和(或)使其成为治疗靶标是当前胰腺肿瘤研究工作者最迫切的任务之一.
李淑德, 主任医师, 中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科; 刘海林, 主任医师, 上海交通大学医学院附属第九人民医院消化科
Midkine基因自从1988年Ka et al从小鼠胚胎肿瘤细胞(HM-1)的cDNA文库中发现至今, 被越来越多的研究证实其在多种恶性肿瘤中高度表达, 而不见表达于相应的正常组织. 在恶性肿瘤患者血液和尿液中能够检测到Midkine表达, 且其表达浓度明显高于正常人并与肿瘤临床病理存在一定相关性, 这使Midkine很有希望成为一种新的肿瘤标志物在肿瘤的诊断、治疗和判断预后中发挥作用.
Owada et al发现Midkine基因可以抑制Caspase介导的细胞凋亡.
本研究显示, Midkine在胰腺癌组织中存在过表达, 其过表达可能起到抑制胰腺肿瘤细胞凋亡的目的, 其机制可能是通过抑制凋亡相关蛋白Caspase-3的活性, 为进一步研究其生物学意义打开思路.
本文探讨胰腺癌Midkine和Caspase-3表达, 有重要理论和临床意义.
编辑: 史景红 电编: 何基才
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