黄芩苷对错配修复基因缺失LoVo细胞的抑制作用及其机制

摘要

目的: 探讨黄芩苷诱导LoVo细胞凋亡的作用及机制.

方法: 将黄岑苷40 mg溶于19.8 mL生理盐水+100 μL HCl+100 μL NaOH, 阿斯匹林1.8 g溶于2 mL乙腈+4 mL NaOH+2 mL HCl, 分别处理LoVo细胞, 1 g/L乙腈溶液为对照. 采用体外培养技术、TUNEL法观察细胞凋亡率, 变性凝胶电泳检测微卫星标志BAT-25、D2S123状况.

结果: 黄芩苷和阿斯匹林均能诱导LoVo细胞凋亡, 在各时间点与对照组比较统计学差异有显著意义(P = 0.0000); 黄芩对结肠LoVo细胞的诱导凋亡作用明显强于阿司匹林, 24 h两者差异无统计学意义, 96 h和1 wk两者差异统计学有显著意义(93.33% vs 44.23%, 63.29% vs 23.20%, 均P = 0.0000), 其作用时间在96 h达到高峰, 与时间不呈依赖关系. 黄芩苷和阿司匹林均未影响LoVo细胞的BAT-25、D2S123微卫星状态.

结论: 黄芩苷具有较强诱导LoVo细胞凋亡的作用, 但对LoVo细胞的BAT-25、D2S123微卫星状态无影响, 其诱导LoVo细胞凋亡可能是通过其它作用途径.

关键词: 黄芩苷; 凋亡; 微卫星不稳定; 聚合酶链反应-单链构象多态性

Inhibitory effect of baicalein on colonic LoVo cell line with deficiency of mismatch repair gene in vitro

Bo-Lin Yang, Fei Liu, Yun-Fei Gu, Hei-Ying Jin, Xiu-Fang Liu

Bo-Lin Yang, Yun-Fei Gu, Department of Colorectal Surgery, the Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Fei Liu, Hei-Ying Jin, Xiu-Fang Liu, National Center of Colorectal Surgery, the Third Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210001, Jiangsu Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30572447.

Correspondence to: Dr. Bo-Lin Yang, Department of Colorectal Surgery, the Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. blyang1971@163.com

Received: May 2, 2008
Revised: June 16, 2008
Accepted: June 23, 2008
Published online: July 28, 2008

Abstract

AIM: To explore the influence of baicalein on the apoptosis of colonic LoVo cell line with deficiency of hMSH2 gene as well as its mechnism.

METHODS: LoVo cells were treated baicalein (40 mg baicalein + 19.8 mL isotonic+100 μL HCl + 100 μL NaOH), aspirin (1.8 g aspirin + 2 mL methyl cyanide+4 mL NaOH + 2 mL HCl) and 1 g/L methyl cyanide (control group). In vitro cell culture technique and TUNEL method were used to measure the apoptosis rate of LoVo cells. Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism and denaturing gel electrophoresis were employed to detect the status of microsatellite markers BAT-25 and D2S123.

RESULTS: Baicalein and aspirin had obvious inhibitory effect on LoVo cells, and the apoptosis rate of LoVo cells was higher than that in the control group at each time point (P = 0.0000). Baicalein was superior to aspirin in inducing apoptosis of LoVo cells at 96 h and 1 wk (93.33% vs 44.23%, 63.29% vs 23.20%; both P = 0.0000). The effect of baicalein reached the peak at 96 h, not in a time-dependent manner. Microsatellite status in BAT-25 and D2S123 were not affected by baicalein or aspirin.

CONCLUSION: Baicalein can induce apoptosis of colonic LoVo cells with deficiency of hMSH2 gene in vitro, without affecting the microsatellite status of BAT-25 and D2S123.

Key Words: Baicalein; Apoptosis; Mcrosatellite instability; Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism

0 引言

遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)是错配修复基因(mismatch repair, MMR)突变导致的常染色体显性遗传性疾病, 约占结直肠癌的5%-15%, 外显率为90%[1]. MMR发生突变, 蛋白表达下降、不表达或出现截短, DNA复制错误增加, 微卫星不稳定(mcrosatellite instability, MSI)而发生结直肠癌. MSI是HNPCC分子表型特征, 90%以上的HNPCC表现为MSI[2]. 目前对HNPCC化学治疗缺少有效的治疗药物, 研究表明HNPCC肿瘤对以5-FU为主的化疗方案具有抵抗作用[3]. 非甾体抗炎药物通过抑制环氧化物酶(COX)来达到降低结直肠癌发生的作用, 在临床预防结直肠癌取得了一定成绩[4]. 研究表明, 清热解毒类中药黄芩、穿心莲等具有类似非甾体抗炎药物的功效, 能通过多途径抑制肿瘤细胞增殖[5-6].

本研究通过黄芩苷干预错配修复基因缺失的结肠癌LoVo细胞(错配修复基因hMSH2缺失), 探讨黄芩苷诱导错配修复基因缺失结肠腺癌LoVo细胞的凋亡作用及其对微卫星序列的影响, 为中药预防和治疗HNPCC肿瘤提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

黄岑苷购自中国中医药研究所. 错配修复基因hMSH2缺失的结肠腺癌LoVo细胞株购自中科院上海细胞所. F12培养基(Gibco生物有限公司); 胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司); In Situ Cell Death Detection Kit, POD(上海罗氏诊断产品有限公司); DAB显色Kit(福建迈新生物工程有限公司); Premix Taq(TaKaRa Bio日本株式会社); 琼脂糖、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TEMED、尿素、过硫酸胺(Sigma生物工程有限公司); 无水碳酸钠、硝酸银、溴酚兰均为国产分析纯; 寡核酸引物Bat-25, D2S123由美国ABI生物有限公司合成(引物序列D2S123:上游5'-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3', 下游5'-GGACTTTCCACCTATGG GAC-3'; Bat-25:上游5'-TCGCCTCCAAGAATGTA AGT-3', 下游5'-TCTGCATT TTAACTATGGCTC-3'). CO₂培养箱、超净工作台、倒置显微镜、ABI9700PCR仪、垂直电泳仪.

1.2 方法

1.2.1 药品处理: 黄岑苷40 mg溶于19.8 mL生理盐水+100 μL HCl(1 mol/L)+100 μL NaOH(1 mol/L), 过滤除菌, 使用浓度为20 μg/mL. 阿斯匹林1.8 g溶于2 mL乙腈(1 g/L)+ 4 mL NaOH(1 mol/L)+2 mL HCl(1 mol/L), 过滤除菌, 使用浓度为2.5 mmol/L 1 g/L乙腈溶液为对照.

1.2.2 细胞培养及样本处理: LoVo细胞以F12培养基, 200 mL/L胎牛血清, 37℃, 50 mL/L CO2培养. 取5×10⁷个/L细胞种于6孔板爬片, 24 h后加药, 分别于48 h, 96 h, 1 wk收集细胞, 无水乙醇固定. 取5×10⁸个/L细胞种于细胞瓶内, 24 h后加药, 分别于48 h, 96 h, 1 wk用2.5 g/L胰蛋酶-EDTA消化收集细胞, 用预冷的PBS洗2次, -20℃冻存备用.

1.2.3 TUNEL法检测细胞凋亡: 取上述不同时间的细胞, 新鲜配制的40 g/L多聚甲醛-PBS液(0.01 mol/L, pH7.4)室温下固定30 min, TBS洗涤; 20 mL/L H₂O₂-甲醛室温孵育30 min, TBS洗涤; 通透液冰浴2 min, TBS洗涤; 加入TUNEL混合液, 37℃湿盒内放置2 h, TBS洗涤; 加入转换液, 37℃湿盒内放置30 min, TBS洗涤; 最后以DAB显色, 苏木精复染并固定. 于倒置显微镜下观察, 核染成棕褐色的细胞为凋亡细胞. 随机数5个以上视野, 计算凋亡细胞所占百分率即为凋亡细胞的标记指数.

1.2.4 单链多态性分析(PCR-SSCP)检测细胞MSI: 采用1997年结直肠癌微卫星DNA不稳定国际专题会议确定的5个MSI检测位点中的BAT-25、D2S123作为检测引物[7], 引物序列来自NCBI基因库(D2S123 Forward: 5'-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3' Reverse: 5'-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3'; Bat-25 Forward: 5'-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3' Reverse: 5'-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3'), 由美国ABI生物有限公司合成. 取上述不同时间位点的细胞, 按DNA抽提试剂盒说明书抽提细胞基因组DNA. 7 g/L琼脂糖电泳检测抽提产物. PCR反应体系20 μL, 模板DNA 1 μL, 上下游引物各2 μL, 去离子H₂O 5 μL, Premix Taq 10 μL. PCR扩增反应方程式: 95℃预变性15 min, 94℃变性40 s, 56℃退火1 min, 72℃延伸40 s, 共30个循环, 72℃充分延伸3 min, 产物4℃保存. 取10 μL PCR扩增产物95℃变性5 min, 迅速置于冰浴; 加入10 μL凝胶上样缓冲液(950 g/L去离子甲酰胺, 20 mmol/L EDTA pH8.0, 50 mg/L溴酚兰, 50 mg/L二甲苯青), 置于80 g/L变性聚丙烯凝胶中250 V恒压电泳6 h后, 水洗、银染显色、拍照. 变性凝胶电泳检测后出现任何不同于正常对照的电泳结果, 包括条带的增加、减少或单链位置不同, 判断为MSI改变.

统计学处理 采用SPSS13.0统计软件作数据处理分析. 不同药物组间采用卡方检验.

2 结果

2.1 不同药物对LoVo细胞的凋亡指数

黄芩、阿斯匹林对结肠LoVo细胞均有明显的诱导凋亡的作用, 被染成棕褐色的细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变(图1). 与对照组相比, 黄芩、阿斯匹林诱导细胞凋亡的作用统计学差异有显著意义(P = 0.0000). 阳性细胞凋亡指数视不同的药物而存在较大的差异, 黄芩对结肠LoVo细胞的诱导凋亡作用明显强于阿司匹林, 24 h两者统计学差异无意义(42.24% vs 29.19%, P = 0.075), 96 h和1 wk时两者统计学差异有显著意义(93.33% vs 44.23%, P = 0.0000; 63.29% vs23.20%, P = 0.0000), 其作用时间在96 h达到高峰, 与时间不呈依赖关系(表1).

表1 不同药物及作用时间与LoVo细胞凋亡指数 (%).

分组	48 h	96 h	1 wk
黄芩	42.24a	93.33b	63.29c
空白对照组	5.30	7.33	7.64
阿斯匹林	29.19	44.23	23.20
乙腈	12.73	10.13	12.82

χ² = 3.15,

^aP = 0.075; χ² = 53.83,

^bP = 0.0000; χ² = 31.13,

^cP = 0.0000 vs 阿司匹林.

图1 96 h黄芩和阿司匹林诱导LoVo细胞凋亡形态学改变. A: 黄芩; B: 阿司匹林.

2.2 黄芩对结肠癌LoVo细胞MSI位点D2S123、BAT-25状态的影响

各时间位点的细胞微卫星位点D2S123、BAT-25的PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖电泳检测, 结果显示PCR扩增满意(图2). PCR-SSCP检测结果显示, LoVo细胞表现为MSI, 但对照组、黄芩、阿司匹林干预后条带均未发生增加、减少或单链位置改变, 提示药物干预后MSI状态无变化(图3).

图2 琼脂糖电泳检测PCR扩增产物. A: D2S123; B:BAT-25.

图3 变性凝胶电泳检测药物干预后96 h的MSI状态. A: D2S123; B: BAT-25; a: 黄芩; b: 空白对照组; c: 阿司匹林; d: 乙腈.

3 讨论

HNPCC是一种常染色体显性遗传性疾病, 约占结直肠癌的5%-15%, 其外显率为90%[1]. HNPCC的遗传学基础是MMR的突变. 错配修复基因在DNA复制过程中水解错配的碱基而维持DNA的精确复制, 保证人类遗传的保守性和稳定性. 一旦该基因发生突变, 错配修复蛋白表达下降、不表达或出现截短, DNA复制错误增加, 微卫星不稳定而致结直肠癌及其他肠外肿瘤的发生, 该机制是结直肠癌发生的另一个途径. MSI是HNPCC肿瘤的一个重要特征, 90%以上的HNPCC家系中的肿瘤具有MSI的特征, 15%散发性结直肠癌表现为MSI[2].

目前对MSI结直肠癌化学治疗缺少有效的治疗药物, 多个研究显示MSI结直肠肿瘤对以5-FU为主的化疗方案具有抵抗作用[3,8-9]. Corleto et al[11]研究了225例HNPCC, 10.2%的患者5年内发生异时性结直肠癌; Wagner et al[10]认为在手术切除了原发结肠肿瘤后, 45%的患者在10年内再次发生结肠癌. 寻求预防和治疗HNPCC有效的药物有利于提高HNPCC治愈率. 非甾体类抗炎药在FAP预防和治疗作用已得到广泛的承认, 其主要通过抑制COX-2达到预防和治疗FAP息肉和结直肠癌的作用[4]. 黄芩苷是唇形科植物黄芩的有效成分之一, 有清热解毒、抗炎、利胆、抗变态反应等作用, 具有类似非甾体抗炎药物如阿司匹林、消炎痛等的功效. 最近研究表明这些中药可以诱导细胞凋亡、抑制肿瘤发生, 有一定的抗肿瘤及预防肿瘤的作用. 本研究结果显示黄芩苷和阿司匹林都能够诱导错配修复基因hMSH2缺失的结肠LoVo细胞凋亡, 与对照组之间存在显著差异(P = 0.0000). 在48 h时, 黄芩、阿斯匹林诱导结肠LoVo细胞凋亡作用无显著差异, 96 h和1 wk时统计学差异有显著意义, 黄芩明显优于阿斯匹林(P = 0.0000), 其作用时间在96 h达到高峰, 与时间不呈依赖关系. 目前关于黄芩诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚不明确. Matsuzaki[12]认为黄芩诱导肿瘤细胞凋亡的机制与有效抑制DNA复制的拓钋异构酶-2活性有关. Chenn et al[13]研究发现黄芩能够上调促凋亡基因BAX, 下调凋亡抑制基因bcl-2而诱导细胞凋亡.

Rüschoff et al[14]研究发现70% HNPCC结肠癌中COX-2基因呈低表达, 认为非甾体抗炎药并不是通过抑制COX-2途径来诱导HCT116细胞(hMLH1缺失)和LoVo细胞凋亡, 其研究结果显示发生凋亡的细胞中微卫星不稳定下降, 并从生长细胞中消失. Goel et al[15]在HCT-116细胞、HCT-116+chr3细胞和SW480细胞加入阿司匹林, 发现这3株细胞在48 h和72 h可以发生凋亡, 而且3株细胞的hMLH1、hPSM2、hMSH6和hMSH2基因表达均提高. 本研究发现尽管黄芩对错配修复基因hMSH2缺失LoVo细胞有较强的促凋亡作用, 但PCR-SSCP检测药物作用的不同时间位点微卫星标志BAT-25、D2S123, 条带未发生改变, 黄芩苷诱导LoVo细胞凋亡可能通过其他途径. 本实验采用的MSI检测位点较少, 药物作用时间较短, 检测方法敏感性等, 结果可能存在误差. 在另一项应用荧光多重聚合酶链反应法检测结直肠癌微卫星不稳定的研究结果显示准确性和敏感性明显高于SSCP法[16]. 因此, 本研究拟进一步延长药物作用时间、扩大MSI检测位点和检测错配修复基因蛋白定量的改变, 并通过其他途径深入研究黄芩苷在MSI肿瘤预防和治疗机制.

针对癌变机制在分子水平上进行化学干预已成为令人关注的领域, 寻找具有特异性治疗和预防MSI结直肠癌的有效治疗药物对提高结直肠癌患者生存率具有重要意义. 本研究显示黄芩有较强的诱导错配修复基因缺失的结肠腺癌LoVo细胞凋亡作用, 作用效果较阿司匹林强, 对其作用机制的深入研究有利于开辟中药防治HNPCC肿瘤的新途径.

评论

背景资料

遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)占所有结直肠癌的5%-15%. HNPCC分子遗传学基础是错配修复基因种系突变, 细胞增殖过程中的错误掺入和缺失不能修复, 基因组DNA微卫星序列发生延长或缩短, 导致结直肠癌及肠外肿瘤的发生.

同行评议者

王正康, 教授, 北京中日友好医院普通外科.

研发前沿

HNPC- C患者未能从以5-FU为基础的化疗中获益. 针对HNPCC肿瘤特异性的发病机制, 寻求能够调控和修复MMR基因功能表达的有效药物对HNPCC患者及家族携带者的预防和治疗具有重要意义.

相关报道

国外最新研究表明非甾体类抗炎药可以通过提高MMR基因的蛋白表达, 降低微卫星不稳定而诱导错配修复缺失的肿瘤细胞凋亡. 黄芩等清热解毒类中药具有类似非甾体抗炎药物的作用, 多个研究表明黄芩苷具有抑制肠癌、前列腺癌肿瘤细胞的作用.

应用要点

本研究显示黄芩苷具有特异性抑制错配修复基因缺失的结直肠癌细胞株作用, 其作用效果明显强于阿司匹林, 黄芩可望成为临床预防和治疗HNPCC的中药.

同行评价

本文立题有新颖性, 设计科学, 结果客观、可信, 对指导临床HNPCC的治疗有一定参考价值.

备注

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

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