神经型钙黏附蛋白的表达对食管鳞癌侵袭和转移的影响

摘要

目的: 探讨神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)在食管鳞癌组织中的表达及其临床病理意义, 以及RNA干扰(RNAi)沉默N-cadherin基因表达对人食管癌细胞系EC9706体外侵袭能力的影响.

方法: 采用免疫组织化学PV法和RT-PCR检测62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜组织中N-cadherin蛋白和mRNA的表达. 将N-cadherin基因的RNA干扰载体稳定转染至EC9706, 通过RT-PCR和Western blotting检测RNAi的效果; 运用Transwell体外侵袭实验检测RNAi后细胞侵袭能力的改变.

结果: 正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中N-cadherin的阳性表达率依次升高, 分别为29.0%(18/62)、61.3%(19/31)、75.8%(47/62), 组间比较差异有统计学意义(P<0.05); N-cadherin蛋白的阳性表达率与食管鳞癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移密切相关(χ² = 6.916, 6.924, 4.486, P<0.05). 食管鳞状细胞癌组织中N-cadherin mRNA 的相对含量高于癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织(0.6631±0.0162 vs 0.4613±0.0239, 0.1538±0.0192), 组间比较差异有统计学意义(χ² = 819.242, P<0.01). RNAi后EC9706中N-cadherin的表达显著下降; Transwell小室体外侵袭实验显示, EC9706的体外侵袭能力也降低.

结论: 食管鳞癌组织中N-cadherin的高表达与食管鳞癌的浸润、恶化有密切的关系. RNAi沉默N-cadherin基因表达能够使EC9706体外侵袭能力降低.

关键词: 食管鳞癌; RNA干扰; 神经性钙黏附蛋白; EC9706细胞

Effects of N-cadherin expression on the invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma

Ke Li, Xin Wang, Wei He, Na Lin, Qing-Xia Fan

Ke Li, Xin Wang, Wei He, Na Lin, Qing-Xia Fan, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, He'nan Province, China

Supported by: the Science and Technology Foundation of Science and Technology Committee of He'nan Province, No. 072102310054.

Correspondence to: Professor Qing-Xia Fan, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, He'nan Province, China. fqx2243@yahoo.com.cn

Received: April 20, 2008
Revised: May 22, 2008
Accepted: May 27, 2008
Published online: July 28, 2008

Abstract

AIM: To explore the relationship between N-cadherin expression and clinicopathological significance in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), and to investigate the invasive ability change of EC9706 cells after N-cadherin gene was silenced by RNA interference (RNAi) technique.

METHODS: PV immunohistochemical method and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect the expression of N-cadherin in 62 cases of normal esophageal epithelia, 31 cases of adjacent atypical hyperplasia and 62 cases of ESCC at protein and mRNA level, respectively. N-cadherin siRNA was transfected into EC9706 cells to inhibit the expression of N-cadherin. The effect of RNAi was detected by RT-PCR and Western blot. The invasive ability of EC9706 cells was determined by Transwell assay.

RESULTS: The expression of N-cadherin protein increased by turns in normal esophageal epithelia, adjacent atypical hyperplasia and carcinoma specimens, which was 29.0% (18/62), 61.3% (19/31), and 75.8% (47/62), respectively. There was a significant difference among the groups (P < 0.05). N-cadherin protein expression was related with the invasion, differentiation, and lymph node metastasis (P < 0.05). The expression of N-cadherin mRNA in ESCC was significantly higher than that in atypical hyperplasia and normal esophageal mucosa (0.6631 ± 0.0162 vs 0.4613 ± 0.0239, 0.1538 ± 0.0192; χ² = 819.242, P < 0.01). N-cadherin mRNA expression was related with the differentiation, infiltration depth, and lymph node metastasis (P < 0.05). After RNAi , the expression of N-cadherin was significantly decreased in EC9706 cells, and the cell invasive abilitiy was also markedly decreased.

CONCLUSION: High-level expression of N-cadherin has a close relationship with the invasion and metastasis of ESCC. RNAi-induced down-regulation of N-cadherin may impair the invasive abilitiy of EC9706 cells.

Key Words: Esophageal squamous cell carcinoma; RNA interference; N-cadherin; EC9706 cell

0 引言

恶性肿瘤的侵袭和转移严重威胁着患者的生命. 钙黏附分子家族(cadherin family)和肿瘤的侵袭和转移密切相关, 其中以上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)和神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)分布最广泛. 国内外已有许多研究表明食管鳞癌的浸润转移与E-cadherin的低表达或不表达有关[1-2]. 最近研究表明, 在前列腺癌, 乳腺癌中N-cadherin表达增多, 并且在引起肿瘤浸润转移方面有着比E-cadherin减少更为重要的作用[3-4]. N-cadherin对于肿瘤上皮细胞及表达N-cadherin的血管平滑肌细胞和外皮细胞之间的黏附起着重要的作用. 在肿瘤形成的过程中, N-cadherin 的表达有助于血管形成及上皮细胞-间质细胞的迁移, 从而使肿瘤细胞更加富于侵袭性, 易于转移[5].

鉴于上述, 本研究首先对食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织中N-cadherin蛋白和mRNA的表达进行检测, 分析其与食管鳞癌临床诸病理因素的关系, 然后运用RNA干扰技术, 从RNA水平降低N-cadherin基因在人食管癌细胞系EC9706中的表达, 以观察N-cadherin基因表达下调对食管癌细胞系EC9706侵袭能力的影响, 从而为食管癌侵袭机制的研究提供新的思路, 并为其临床治疗提供新的靶点.

1 材料和方法

1.1 材料

pEGFP-MSCVneo质粒和pMSCVneo/N-cadherin质粒(由协和医科大学马杰博士馈赠). pEGFP-MSCVneo质粒大小7.2 kb, 内含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因序列和多克隆位点, 在细胞内表达后可发出绿色荧光. 原核细胞中的筛选标记为氨苄青霉素, 真核细胞中为新霉素. pMSCVneo/N-cadherin质粒大小为7.5 kb, 内含EGFP基因序列、U6启动子序列和多克隆位点等. 人食管癌细胞株EC9706由中科院提供. DH5α菌株(由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠). RNA提取试剂盒(美国Qiagen公司); RevertTM First Stand cDNA Synthesis Kit(加拿大MBI Fermentas公司); PCR试剂盒(上海生物工程公司); N-cadherin一抗(鼠抗人mAb, 美国Abcam公司); Matrigel matrix(美国BD公司); 脂质体Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司); 新霉素G418(美国Gibco-BRL公司); 标准核酸分子量参照物: 100 bp DNA Ladder Marker(大连TaKaRa公司); 内对照β-actin引物、N-cadherin引物、MMP-9引物(上海生物工程公司); Transwell小室(美国Costar公司).

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测N-cadherin蛋白在食管鳞癌组织中的表达: (1)标本及处理, 62例食管鳞癌手术切除标本于2006-02-26/03-16取自安阳市肿瘤医院. 其中男36例, 女26例, 年龄38-75岁, 所有病例均病理学诊断明确, 且术前均无化疗、放疗及免疫治疗史. (2)免疫组织化学染色, 62例标本分别取无坏死癌灶、癌旁组织(距癌灶3 cm以内)及远端(距癌灶5 cm以上)正常黏膜组织(经HE染色证实, 癌旁组织中31例有不典型增生), 经40 g/L多聚甲醛固定, 常规脱水, 石蜡包埋, 连续切片, 切片厚度4-6 μm. 62例均经组织学证实为鳞状细胞癌. 其中组织学分级Ⅰ级15例, Ⅱ级25例, Ⅲ级22例; 伴淋巴结转移者20例, 无淋巴结转移者42例. 浸润黏膜下层或浅肌层者7例, 浸润深肌层或外膜层者55例. 浓缩型鼠抗人神经型钙黏附蛋白mAb, 工作浓度1:110; 二步法免疫组化检测试剂(PV-9000); DAB显色增强剂. 染色方法严格参照免疫组化PV-9000试剂盒说明书进行操作, 以PBS液代替一抗作为阴性对照. (3)结果判断标准, 胞膜/胞质棕黄色染色为阳性, N-cadherin以胞质染色为主, 按着色强度和阳性细胞比例进行综合评分, 阳性比例30%以下为1分, 30%-60%为2分, 60%以上为3分, 着色程度: 无着色为0分(阴性), 浅黄色为1分(弱阳性), 棕黄色为2分(阳性), 棕褐色为3分(强阳性), 然后根据两者乘积的积分进行统计分析, 0-1分为阴性(-), 2-3分为弱阳性(+), ≥4分为阳性(++)[6]. (4)食管鳞癌组织中N-cadherin mRNA的RT-PCR检测, 取冰冻新鲜组织, 按试剂盒说明进行RT-PCR. 内对照β-actin上游引物: 5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'; 下游引物5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'; PCR产物480 bp, N-cadherin上游引物: 5'-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3'; 下游引物5'-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3'; PCR产物204 bp. 反应条件为: 94℃预变性5 min, 进入PCR循环: 95℃ 30 s, 62℃ 50 s, 72℃ 60 s, 35个循环后72℃延伸7 min. PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 于紫外灯下观察照相. 采用德国Kontron公司IBAS2.0真彩图像分析仪对条带灰度值进行扫描分析.

1.2.2 RNA干扰沉默N-cadherin基因在人食管癌细胞系EC9706中的表达及其对细胞体外侵袭能力的影响: (1)阳离子脂质体转染及抗性克隆的筛选和扩增. 将EC9706接种至6孔培养板中, 待其融合达90%-95%时, 用脂质体法对其进行转染(具体方法参照Lipofectamine^TM 2000说明书). 转染共分4组: 正常对照组、脂质体组、pEGFP-MSCVneo质粒组(空载体组)、pMSCVneo/N-cadherin质粒组(干扰载体组). 选用G418进行抗性克隆的筛选和扩增, 初选浓度为600 mg/L(由预实验得出), 10-15 d后降为300 mg/L, 继续维持10-15 d. 转染后的细胞每隔3-4 d在荧光显微镜下488 nm波长处观察荧光. (2)RT-PCR检测EC9706转染前后N-cadherin mRNA的表达, 选用正常对照组、空载体组、干扰载体组、乳腺癌细胞系435(阳性对照组)4组细胞, 按试剂盒说明进行RT-PCR. 内对照β-actin上游引物: 5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'; 下游引物5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'; PCR产物480 bp, N-cadherin上游引物: 5'-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3'; 下游引物5'-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3'; PCR产物204 bp. 反应条件为: 94℃预变性5 min, 进入PCR循环: 95℃ 30 s, 62℃ 50 s, 72℃ 60 s, 35个循环后72℃延伸7 min. PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 于紫外灯下观察照相. 采用德国Kontron公司IBAS2.0真彩图像分析仪对条带灰度值进行扫描分析. (3)Western blotting检测转染前后N-cadherin的蛋白表达, 分别取正常对照组、空载体组、干扰载体组、阳性对照组4组细胞消化、PBS洗涤后, 用如下裂解液提取细胞总蛋白: 0.1 mol/L NaCL, 0.01 mol/L Tris-HCL(pH值为7.6), 0.001mol/L EDTA(pH值为8.0), 1 mg/L Aprotinin, 100 mg/L苯甲基磺酰胺(PMSF), PMSF不稳定, 用前现加. PMSF通常配制成10或100 mmol/L浓度的储存液(1.74 g或者17.4 g/L溶解于异丙醇中)保存于-20℃. 离心取上清, 用BCA试剂盒进行蛋白定量. 取等量蛋白60 μg上样于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶, 再转移至硝酸纤维素膜, 膜于含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1 h, 加以封闭液稀释的N-cadherin兔抗人mAb(1:2000), 4℃过夜. 次日用TBST洗膜3×15 min, 加封闭液稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG(1:500), 室温摇床温育1 h, TBST洗膜3×15 min, 加ECL试剂, 胶片(Kodak)曝光, 洗片. 采用德国Kontron公司IBAS2.0真彩图像分析仪对条带灰度值进行扫描分析. (4)RT-PCR检测EC9706转染前后MMP-9 mRNA的表达, 选用正常对照组、空载体组及干扰载体组3组细胞, 按试剂盒说明进行RT-PCR. 内对照β-actin同上, MMP-9上游引物: 5'-TGGAGTCACTGTACACCCTC-3'; 下游引物5'-CGGACATCCGCTAAACAGGT-3'; PCR产物400 bp. 反应条件为: 94℃预变性5 min, 进入PCR循环: 95℃ 30 s, 58℃ 50 s, 72℃ 60 s, 35个循环后72℃延伸7 min. PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 于紫外灯下观察照相. 采用德国Kontron公司IBAS2.0真彩图像分析仪对条带灰度值进行扫描分析. (5)Transwell小室体外侵袭试验, 将冻存于-80℃冰箱的基质胶(matrigel)4℃过夜(24 h), 变成液态; 取300 μL无血清培养基, 加入60 μL(或50 μg/室)Matrigel, 混匀, (4℃操作, 最好在冰浴上), 加入上室各100 μL(3个室); 放入37℃培养箱中, 孵育4-5 h(>5 h); 此间经常观察, 当出现"白色层"时, 说明已经变为固态; 收获正常对照组、空载体组及干扰载体组三组细胞, 分别用不含胎牛血清的DMEM悬浮, 制备单细胞悬液, 将细胞密度调至5×10⁸/L; 用无血清培养基洗Matrigel 1次; 每孔加入100 μL细胞悬液; 下腔室中加入500 μL含有200 mL/L FBS条件培养基; 37℃培养箱中, 孵育20-24 h; 弃去上室液体, 小心取出上室, 用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞, 用70%甲醇固定45 min, 未结合型苏木素染色5 min, 流水冲洗终止. 光学显微镜下观察迁徙至膜上的细胞, 每孔计数5个高倍镜视野(×100)中的细胞数总和, 求其平均值. 穿膜的细胞数目多少作为评价肿瘤细胞浸润能力强弱的指标.

统计学处理 所获实验数据均采用SPSS11.0版软件包进行统计学处理. 所有数据采用mean±SD表示, 多组均数间比较采用单因素方差进行统计分析. 检验水准α = 0.05.

2 结果

2.1 N-cadherin蛋白表达及其与临床生物学行为的关系

N-cadherin阳性信号定位于细胞质, 呈黄色或棕黄色, 其在正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及癌组织中的表达依次升高29.0%(18/62)、61.3%(19/31)、75.8%(47/62), 组间比较差异有统计学意义(P<0.05, 图1, 表1). 与食管鳞癌分化程度、浸润转移的关系见表2.

表1 食管鳞癌组织、非典型增生组织及正常食管黏膜组织中N-cadherin mRNA和蛋白表达.

病理学参数	n	N-cadherin mRNA表达		χ2	P	N-cadherin蛋白表达		χ2	P
		+	相对含量			+	阳性率(%)
正常黏膜上皮	62	21	0.1538±0.0192			18	29.0
非典型增生	31	25	0.4613±0.0239	819.242	0.000	19	61.3	29.091	0.000
鳞癌	62	52	0.6631±0.0162			47	75.8

图1 N-cadherin的表达(PV×200). A: 正常食管黏膜组织; B: 食管鳞癌组织.

表2 食管鳞癌组织中N-cadherin mRNA和蛋白表达与临床病理学参数的关系.

病理特征	N-cadherin mRNA表达				N-cadherin蛋白表达
	n	相对含量	F/t	P	阳性(n, %)	χ2	P
组织分级
Ⅰ	10	0.5664±0.0123			8(53.3)
Ⅱ	21	0.6408±0.0078	555.231	0.000	19(76.0)	6.924	0.031
Ⅲ	21	0.7417±0.0064			20(90.9)
浸润深度
浅层	3	0.5814±0.0346	75.866	0.000	2(28.6)	6.916	0.009
深层	49	0.7470±0.0140			45(81.8)
淋巴结转移
无	30	0.6857±0.0907	7.269	0.012	28(66.7)	4.486	0.034
有	22	0.7835±0.1072			19(95.0)

2.2 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常黏膜组织中N-cadherin mRNA的表达

N-cadherin mRNA RT-PCR扩增产物与预计一致, 其片段大小为204 bp, 内参β-actin片段大小为480 bp(图2). 扩增结果经凝胶灰度扫描而对N-cadherin mRNA表达进行定量, 在食管鳞癌癌变过程中N-cadherin在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及癌组织中mRNA的含量依次增高, 组间比较差异有统计学意义(P<0.05, 表1). 不同临床病理特征患者食管组织中N-cadherin mRNA相对含量见表2.

图2 食管鳞癌、癌旁及相应正常食管黏膜中N-cadherin的mRNA表达. 1: 正常食管黏膜; 2: 癌旁组织; 3: 食管鳞癌组织; M: marker.

2.3 阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选与扩增

转染24 h后在荧光显微镜下488 nm波长处观察, 空载体组及干扰载体组均可见明亮的绿色荧光, 胞质和胞核都有, 并可维持1 mo以上(图3). 正常对照组、脂质体组未见绿色荧光. 当G418以600 mg/L的初选浓度作用10-15 d后, 正常对照组、脂质体组细胞绝大部分死亡, 然后将G418浓度降为300 mg/L维持, 10-15 d后正常对照组、脂质体组细胞全部死亡, 从而得到稳定表达EGFP的EC9706, 后续培养中仍用300 mg/L的G418维持.

图3 转染30 d后倒置荧光显微镜下干扰载体组EC9706细胞观(×400).

2.4 RT-PCR检测转染前后EC9706 N-cadherin的mRNA表达

4种细胞均扩出480 bp的β-actin内参带, 阳性对照组、正常对照组和空载体组细胞均可见清晰的约204 bp的N-cadherin目的条带, 而干扰载体组细胞的目的条带亮度明显减弱, 差异有统计学意义(P<0.05, 图4).

图4 EC9706细胞转染前后N-cadherin mRNA的相对表达量. 1: 阳性对照组; 2: 正常对照组; 3: 空载体组; 4: 干扰载体组; M: 100 bp Marker. ^aP<0.05 vs 正常对照组和空载体组.

2.5 Western blotting检测EC9706转染前后N-cadherin的蛋白表达

空载体组中N-cadherin的蛋白表达与正常对照组相比无明显变化, 而干扰载体组中N-cadherin的蛋白表达与正常对照组相比则明显降低, 差异有统计学意义(P<0.05, 图5).

图5 EC9706细胞转染前后N-cadherin蛋白表达. 1: 阳性对照组; 2: 正常对照组; 3: 空载体组; 4: 干扰载体组. ^aP<0.05 vs 正常对照组和空载体组.

2.6 RT-PCR检测EC9706转染前后MMP-9的mRNA表达

3组细胞均扩出480 bp的β-actin内参带, 正常对照组和空载体组细胞均可见清晰的约400 bp的MMP-9目的条带, 而干扰载体组细胞的目的条带亮度减弱, 差异有统计学意义(P<0.05, 图6).

图6 EC9706细胞转染前后MMP-9 mRNA表达. 1: 干扰载体组; 2: 空载体组; 3: 正常对照组; M: 100 bp Marker. ^aP<0.05 vs正常对照组和空载体组.

2.7 转染前后EC9706各组细胞的体外侵袭能力分析

正常对照组、空载体组及干扰载体组之间比较, 干扰载体组穿膜的细胞数显著减少, 差异有统计学意义(P<0.05, 图7-8).

图7 Transwell小室体外侵袭实验穿膜细胞(HE×200). A: 正常对照组; B: 空载体组; C: 干扰载体组.

图8 Transwell小室体外侵袭实验穿膜细胞数的比较. ^aP<0.05 vs 正常对照组和空载体组.

3 讨论

N-cadherin在食管鳞癌组织中的表达及其临床病理意义, 目前已知的与肿瘤转移有关的黏附分子可分为5类: 整合素家族、选择素家族、免疫球白超家族、钙黏附蛋白家族和未归类的黏附分子. 钙黏附分子家族由一系列结构和功能相似的单链跨膜糖蛋白组成. 经典的钙黏附蛋白按其最初来源分为: E-cadherin(上皮型)、N-cadherin(神经型)、P-cadherin(胎盘型)3种, 分子质量均约为120 kDa, 主要参与介导钙离子依赖的同型细胞间的黏附. 该家族的特点是既可以作为受体, 又可以作配体按嗜同类结合方式而相互结合, 对细胞识别、迁徙、归类行为及在维持正常组织结构方面起着重要作用, 参与调节组织发生和形态分化[7].

最近研究表明[3-4], N-cadherin在乳腺癌、前列腺癌的表达增多, 并且在引起肿瘤的浸润和转移方面有比E-cadherin的减少更为重要的作用. Utsuki et al[8]发现在脑胶质母细胞瘤和星形细胞瘤中N-cadherin的表达增加, 并且和肿瘤的病理分级相关, 而E-cadherin的表达减少. Makagiansar et al[9]发现N-cadherin可以增加恶性T细胞瘤对上皮细胞的黏附力, 使其更容易发生转移.

本研究结果显示, 随着食管鳞癌浸润深度增加、分化程度降低及发生转移N-cadherin蛋白的阳性表达率增加, 且差异均有统计学意义(P<0.05). RT-PCR结果亦证实: 在正常食管黏膜、癌旁不典型增生及食管鳞状细胞癌组织中均发现N-cadherin mRNA的表达, 但3组间N-cadherin mRNA相对含量比较, 差异有统计学意义(χ² = 819.242, P<0.01). 不同分化程度、不同浸润深度及有无淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织之间N-cadherin mRNA相对含量差异均有统计学意义(P<0.05), 从而提示N-cadherin可以作为食管鳞癌浸润转移的预测指标.

RNA干扰沉默N-cadherin基因在人食管癌细胞系EC9706中的表达及其对细胞体外侵袭能力的影响. 为了进一步验证N-cadherin基因表达与食管癌浸润、转移的关系, 本研究将N-cadherin 基因的RNA干扰载体pMSCVneo/N-cadherin质粒稳定转染至人食管癌细胞系EC9706, RT-PCR和Western blotting结果显示: 稳定转染干扰载体的EC9706中N-cadherin的mRNA和蛋白表达水平均明显下降, 同时通过Transwell小室体外侵袭实验证明, 伴随着N-cadherin的mRNA和蛋白表达水平的下降, EC9706的体外侵袭能力也随之下降.

肿瘤细胞的浸润和转移包括肿瘤细胞通过黏附作用脱离原发灶, 移动到基底膜, 降解细胞外基质, 突破组织屏障结构, 局部浸润或远距离及全身组织扩散, 而N-cadherin对于肿瘤上皮细胞及表达N-cadherin的血管平滑肌细胞和外皮细胞之间的黏附起着重要的作用. 在肿瘤形成的过程中, N-cadherin的表达有助于血管形成及上皮细胞-间质细胞的迁移, 从而使肿瘤细胞更加富于侵袭性, 易于转移[5]. Nieman et al[10]将外源性N-cadherin基因转入E-cadherin表达阳性的乳腺癌细胞, 尽管转染后的细胞E-cadherin表达仍为阳性, 但细胞的迁移和侵袭能力却得以加强.

对于N-cadherin表达下调导致人食管癌细胞EC9706的体外侵袭能力下降的可能机制本研究也进行了初步探讨. Suyama et al[5]的研究发现N-cadherin的增加可以通过FGF激活MAPK- ERK信号转导途径, 诱导MMP-9基因表达, 有利于肿瘤血管的形成, 使肿瘤易于生长和转移. 基质金属蛋白酶(matrix metal loproteinases, MMPs)是一组结构中含Zn²⁺和Ca²⁺的蛋白水解酶家族, MMP-9的主要底物均为Ⅳ/Ⅴ型胶原, 故也称为Ⅳ型胶原酶(明胶酶). Ⅳ型胶原为基底膜中结构蛋白, 对维持基底膜的完整性至关重要. 由于Ⅳ型胶原独特的螺旋结构, 因此大部分蛋白酶对其无降解作用, 但MMP-9可以降解Ⅳ型胶原和层粘连蛋白等成分, 破坏基底膜的完整性[11-14], 这是肿瘤浸润和转移的先决条件. 为此, 本研究通过RT-PCR检测了转染前后EC9706中MMP-9的mRNA表达水平的变化, 结果表明, 伴随着N-cadherin的mRNA和蛋白表达水平的下降, EC9706中MMP-9 mRNA表达水平也随之下降, 从而提示, N-cadherin的表达下调可能通过下调MMP-9的表达, 降低细胞对细胞外基质的降解能力, 进而降低细胞的体外侵袭能力. 至于N-cadherin是如何通过MMP-9发挥作用, 尚需进一步的研究.

总之, 本研究首先从mRNA和蛋白水平证实N-cadherin与食管鳞状细胞癌的发生、侵袭及转移有关; 然后又通过RNA干扰技术, 使得人食管癌细胞系EC9706中N-cadherin mRNA和蛋白表达水平下调, 同时MMP-9 mRNA表达水平也随之下调, 伴随着两者表达的下调, 人食管癌细胞系EC9706的体外侵袭能力也随之下降, 从而提示, 食管癌的侵袭、转移可能是N-cadherin和MMP-9共同作用的结果, 为食管癌侵袭机制的研究提供新的思路, 并为其临床治疗提供新的靶点.

评论

背景资料

钙黏附分子家族(cadherin family)和肿瘤的侵袭转移密切相关, 其中以上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)和神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)分布最广泛. 国内外已有许多研究表明食管鳞癌的浸润转移与E-cadherin的低表达或不表达有关. 最近研究表明, 在前列腺癌, 乳腺癌中N-cadherin表达增多, 并且在引起肿瘤浸润转移方面有着比E-cadherin减少更为重要的作用.

同行评议者

李瑗, 教授, 广西肿瘤研究所; 陈公琰, 主任医师, 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内一科.

研发前沿

关于N-cadherin介导的肿瘤细胞浸润、转移的具体机制已成为研究的热点.

相关报道

国内外研究表明, 前列腺癌、直肠癌、乳腺癌等N-cadherin基因表达量与肿瘤的侵袭力成正相关, N-cadherin基因可能通过MAPK- ERK等信号转导途径促进肿瘤细胞的浸润转移.

创新盘点

本研究首次采用免疫组织化学PV法和RT-PCR检测了N-cadherin在食管鳞癌组织中的表达; 在研究N- cadherin的作用机制时, 首次采用了RNA干扰技术, 通过降低N-cadherin在EC9706细胞中的表达来分析其对细胞侵袭力的影响.

应用要点

本研究为食管癌侵袭机制的研究提供新的思路, 并为其临床治疗提供新的靶点.

名词解释

Transwell小室体外侵袭试验: 将Transwell小室放入培养板中, 小室内称上室, 培养板内称下室, 上室内盛装上层培养液, 下室内盛装下层培养液, 上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔. 先在膜上涂一层基质胶, 模拟细胞外基质, 然后将细胞种在上室内, 由于聚碳酸酯膜有通透性, 下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞, 从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响.

同行评价

本研究的内容是肿瘤治疗领域较为重要的一个方面, 有较好的前沿性、新颖性, 也符合伦理学要求, 具有一定的学术价值.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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