IL-10对TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞CTGF表达的影响

摘要

目的: 探讨IL-10对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)表达CTGF的影响及其抗纤维化的可能机制.

方法: 体外培养大鼠肝星状细胞系rHSC-99, 分别用不同浓度的IL-10、TGF-β₁干预和两者共同干预48 h后, 采用半定量 RT-PCR法检测各组肝星状细胞中CTGF mRNA表达水平.

结果: TGF-β₁单独干预HSC, CTGF mRNA表达水平与对照组比较均明显增强(P<0.05); 不同浓度的IL-10单独干预HSC, 各目的基因表达与对照组比较无明显统计学意义; 不同浓度的IL-10与TGFβ₁共同干预HSC, CTGF mRNA表达水平与TGF-β₁组比较均明显降低(P<0.05).

结论: IL-10可显著抑制由TGF-β₁诱导的CTGF mRNA的表达, 这可能是其抗纤维化的机制之一.

关键词: 白介素-10; 转化生长因子; 肝星状细胞; 结缔组织生长因子

Effect of interleukin-10 on TGF-β₁-induced CTGF expression in hepatic stellate cells

Yue-Jie Yang, Fen Huang, Jing Hu, Li Ma, Zhi-Wei Li

Yue-Jie Yang, Fen Huang, Jing Hu, Li Ma, Zhi-Wei Li, Department of Infectious Diseases, Shengjing Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Correspondence to: Fen Huang, Department of Infectious Diseases, Shengjing Affiliated Hospital of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping Distict, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. hfzyq1962@sina.com

Received: February 28, 2008
Revised: April 17, 2008
Accepted: April 21, 2008
Published online: July 8, 2008

Abstract

AIM: To investigate the effect of interleukin-10 (IL-10) on the expression of connective tissue growth factor (CTGF) in hepatic stellate cells (HSC) and its possible antifibrogenic mechanism.

METHODS: Hepatic stellate cells (rHSC-99) cultured in vitro was exposed to various concentrations of IL-10 and/or TGF-β₁ for 48 h and then expression level of CTGF mRNA was measured by semi-quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

RESULTS: The expression level of CTGF mRNA, compared with control group, markedly increased when HSC was only exposed to TGF-β₁ (P < 0.05); when HSC was only exposed to various concentrations of IL-10, target gene expression showed no significance; the expression level of CTGF mRNA markedly decreased when HSC was exposed to TGF-β₁ in combination with different concentrations of IL-10 (P < 0.05).

CONCLUSION: IL-10 remarkably inhibits TGF-β₁-induced CTGF mRNA expression, which is thought to be one possible antifibrogenic mechanism.

Key Words: Interleukin-10; Transforming growth factor; Hepatic stellate cell; Connective tissue growth factor

0 引言

肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝纤维化时细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过多产生和沉积的主要细胞来源, HSC的激活、增殖在肝纤维化过程中起核心作用. 转化生长因子β₁(transforming growth factor β₁, TGF-β₁)是强有力的致纤维化的细胞因子, 在肝纤维化时表达明显增多, 促进HSC增殖活化, 合成大量ECM, 在纤维化进程中起重要作用[1]. 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是近年来新发现的一种细胞因子, 肝纤维化时肝组织内与血清中CTGF明显增高, 其程度与肝纤维化的病理进展水平呈平行相关关系, CTGF可能是TGFβ的下游效应介质, 可以介导TGFβ的促细胞外基质效应, 而不影响TGFβ免疫抑制和抗细胞增殖效应,是具有多种生理功能的细胞因子, 近年来成为研究热点之一[2]. 白介素-10(interleukin-10, IL-10)是一种炎症抑制因子, 临床和动物实验表明, IL-10可减轻肝脏炎症, 抑制肝纤维化的发展, 可望发展为抗肝纤维化药物, 但其作用机制尚未明确. 我们用IL-10及TGFβ1干预和共干预体外培养的大鼠肝星状细胞系γ-HSC99, 采用半定量RT-PCR法检测各组CTGF mRNA表达, 进一步探讨IL-10抗肝纤维化的作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

γ-HSC99细胞系[3], 为活化的大鼠肝脏星状细胞, 由北京大学附属医院人民医院肝胆外科实验室冷希圣教授惠赠; TGFβ1及重组大鼠IL-10购自Peprotech公司; 逆转录试剂盒和Taq酶购自大连宝生物公司; 引物由Invitrogen公司合成; 总RNA提取试剂(TRIzol)购自Invitrogin公司; DEPC和琼脂糖购自Sigma公司; DNA marker购自MBI公司; DMEM培养基购自Gibco公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 将γ-HSC99细胞复苏后接种于25 cm²培养瓶中, 每瓶加入5 mL含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液, 置37℃、50 mL/L恒温CO₂培养箱中, 细胞为贴壁生长, 每1-2 d以2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.

1.2.2 实验分组: A: 对照组加磷酸盐缓冲液; B: TGFβ₁ 8 mg/L组; C: IL-10 10 mg/L组; D: IL-10 20 mg/L组; E: IL-10 40 mg/L组; F: TGFβ₁ 8 mg/L+IL-10 10 mg/L组; G: TGFβ₁ 8 mg/L+IL-10 20 mg/L组; H: TGFβ₁ 8 mg/L+IL-10 40 mg/L组.

1.2.3 RT-PCR法检测CTGF mRNA的表达: 用 TRIzol试剂提取细胞总RNA; 用分光光度法测定RNA含量及纯度, A₂₆₀:A₂₈₀比值均在在1.8-2.0之间. 采用两步法RT-PCR技术, 设置GAPDH为内参照. 引物序列: CTGF 5'-CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3'(上游), 5'-CTCAAAGATGTCATTGTCCCC-3'(下游); GAPDH 5'-TGGGACGATATGGAGAAGAT-3'(上游), 5'-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3'(下游). 用RNA PCR Kit(AMV)Ver. 310试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应, cDNA合成和预变性: 30℃ 10 min, 42℃ 30 min, 99℃ 5 min, 5℃ 5 min进行1次循环, CTGF PCR扩增条件: 94℃ 2 min进行1次循环, 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 50 s进行32次循环. 取RT-PCR产物在12 g/L琼脂糖凝胶上电泳(100 V, 30 min), 用GDS凝胶成像系统拍摄电泳结果, 各带用计算机图像分析系统扫描定量.

统计学处理 数据以mean±SD表示, 各组之间是否存在显著性差异分析采用One-way ANOVA分析. 进一步各实验组与对照组的比较采用最小显著差值法LSD-t检验. P<0.05确定差异有无显著意义.

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增结果

以细胞总RNA为模板, 进行RT-PCR反应, 扩增产物经凝胶电泳可见分别于383 bp(CTGF)及452 bp(GAPDH)处的清晰扩增条带(图1).

图1 HSC CTGF/GAPDH mRNA RT-PCR产物电泳图.

2.2 灰度分析结果

A-H组CTGF/GAPDH分别为1.02±0.12, 1.38±0.07, 1.05±0.09, 1.01±0.10, 1.01±0.11, 0.82±0.03, 0.72±0.04, 0.62±0.06. TGFβ1组HSC细胞CTGF mRNA表达明显升高, 与空白对照组(A组)比较, 差别有统计学意义(P<0.05); IL-10各浓度组(C-E组)与空白对照组比较, 基因表达差别无明显统计学意义; 同时加入TGFβ1及不同浓度的IL-10(F-H组)与TGFβ1组(B组)比较, CTGF mRNA表达均明显降低, 差别有统计学意义(P<0.05), 并呈剂量依赖效应, 说明IL-10对TGFβ1诱导的CTGF表达有明显的抑制作用(图2).

图2 IL-10对CTGF表达抑制作用. 1: TGFb1; 2: TGFb1+ IL-10 10 mg/L; 3: TGFb1+ IL-10 20 mg/L; 4: TGFb1+ IL-10 40 mg/L;

3 讨论

肝纤维化是肝组织内ECM过度增生和沉积, 降解相对不足的病理过程, HSC的激活和增殖在肝纤维化过程中起核心作用, 以HSC为靶向的研究是近年来抗纤维化机制方面的研究热点. 多项研究表明, TGFβ₁是强有力的致纤维化细胞因子, 在肝纤维化是表达明显增多, 可促进HSC的增殖和活化, 使ECM成分合成增多, 降解减少, 并存在正反馈放大效应, 促进肝纤维化的进程[4-7]. CTGF是近年来新发现的一种细胞因子, 是具有高度保守性的即刻早期基囚CNN家族成员之一. CTGF与肝纤维化有密切的关系[8]. 人类慢性肝病、肝纤维化及实验性肝纤维化发生发展过程中均与CTGF表达有关, 主要是HSC-CTGF mRNA的表达上调, Crean et al[9]用抗CTGF的中和抗体可阻断TGFβ₁引起的促纤维化效应. Mori et al[10]在小鼠皮肤纤维化模型中, TGFβ1可引起短期纤维组织增生, 若同时注射CTGF则可引起持续稳定的纤维组织增生. 进一步研究发现, CTGF启动子中存在TGF-β反应元件, 提示这可能是TGF-β选择性上调CTGF基因表达的分子基础. CTGF可能是TGF-β下游信号效应分子, 特异地介导TGF-β促纤维化效应[11-12], 而不影响TGF-β₁免疫抑制和抗细胞增殖效应. 因此, 作为组织器官纤维化形成过程中的重要介质, CTGF的发现可能为防治肝纤维化提供一个新的靶标. 目前, 抗纤维化药物仍存在其局限性, 进一步研究肝纤维化的机制, 有助于开发研究新药物控制或延缓肝纤维化的发展. 最近文献资料显示, IL-10与慢性肝损害发生发展关系密切, 且具有抗纤维化效应, 可望成为治疗肝纤维化的药物. IL-10是由Th2细胞、巨噬细胞和活化的B细胞产生一种细胞因子. 是一类抑制性免疫调节因子, 具有强大的抑制炎症和巨噬细胞功能的作用. 采用CCl₄构建肝纤维化模型, IL-10基因敲除小鼠较野生型小鼠肝纤维化程度明显加重[13-14], 提示内源性IL-10对肝纤维化起抑制作用. Nelson et al[15]临床试验显示外源性IL-10可减轻患者及动物模型的肝纤维化程度, 但其作用机制尚不明确. 我们建立了TGFβ₁与IL-10干预和共干预体外培养的HSC细胞模型, 采用半定量RT-PCR法检测CTGF mRNA的表达, 结果显示HSC经TGFβ1进一步诱导活化, 表达CTGF mRNA明显增多, 这与以往的研究结果一致; IL-10单独干预, IL-10各浓度组与空白对照组比较, 差别无统计学意义, 说明单用 IL-10对HSC CTGF mRNA表达无明显作用; IL-10与TGFβ₁共同干预, 与TGFβ₁组比较, CTGF mRNA表达明显减少, 且以IL-10 40 mg/L+TGFβ₁ 8 mg/L组抑制作用最明显, 差别有统计学意义, 说明IL-10对TGFβ₁诱导的CTGF mRNA表达有明显的抑制作用. 因此我们推断, IL-10可通过抑制TGFβ₁诱导的CTGF基因表达而发挥抗纤维化效应, 这可能是IL-10抗纤维化机制之一.

评论

背景资料

肝纤维化是由众多因素参与复杂的病理过程. 肝星状细胞(HSC)的活化在肝纤维化过程中起核心作用, 在各种因素刺激下, HSC增殖, 移行, 表达各种细胞外信号转导通路蛋白, 产生大量以胶原为主的细胞外基质(ECM)成分和细胞因子, 促进肝纤维化的发生发展. TGF-β₁是强有力的致纤维化的细胞因子, 促进HSC增殖活化, 合成大量ECM, 在纤维化进程中起重要作用. 目前, 抗纤维化药物仍存在其局限性, 进一步研究肝纤维化的机制, 有助于开发研究新药物控制或延缓肝纤维化的发展.

同行评议者

党双锁, 副教授, 西安交通大学第二医院感染科; 张明辉, 副主任医师, 河北医科大学第一医院肝病中心(传染病)

研发前沿

采用CCl₄构建肝纤维化模型, IL-10基因敲除小鼠较野生型小鼠肝纤维化程度明显加重, 提示内源性IL-10对肝纤维化起抑制作用. 临床试验显示外源性IL-10可减轻患者及动物模型的肝纤维化程度, 但其作用机制尚不明确.

相关报道

最近研究显示, IL-10与慢性肝损害发生发展关系密切, 且具有抗纤维化效应, 可望成为治疗肝纤维化的药物, 但其作用机制尚不明确. CTGF是近年来新发现的一种细胞因子, 可能是TGF-β下游信号效应分子, 特异地介导TGF-β促纤维化效应, 而不影响TGF-β免疫抑制和抗细胞增殖效应. 因此, 作为组织器官纤维化形成过程中的重要介质, CTGF的发现可能为防治肝纤维化提供一个新的靶标.

应用要点

本研究发现IL-10可显著抑制由TGF-β₁诱导的CTGF mRNA的表达, 这可能是IL-10抗纤维化作用机制之一, 有助于进一步指导IL-10的临床应用.

同行评价

本研究方法合理可行, 结果有价值, 对临床基础研究的突破有意义. 如果进一步探讨IL-10与TGFb₁的最佳搭配浓度, 结合机体本身病例状态下观察则更有价值.

备注

编辑:潘伯荣 电编:何基才

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