Dickkopf-1克隆及其抗结肠癌作用

摘要

目的: 探讨Dkk1 cDNA抗结肠癌的机制. 

方法:  利用脂质体介导pcDNA3.1(+)Dkk1进行瞬时转染结肠癌细胞CT26和表达Dkk1的肝癌细胞HEPA1-6, 转染后的细胞为实验组, 转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞和未转染的细胞分别为空载体组和未转染组, 用MTT法检测CT26增殖、免疫印迹法检测细胞Dkk1, p53, Bcl-2和Bax的表达量. 

结果: MTT实验显示在570 nm的吸光度均值CT26实验组明显低于其空载体组和未转染组(0.779±0.025 vs 0.968±0.016, 0.973±0.016), P<0.05); 与CT26空载体组和未转染组相比, 实验组p53, Bcl-2的表达量降低、而Dkk1、Bax表达增高.

结论:  外源Dkk1可反馈抑制突变型p53的生成, 下调Bcl-2, 增加Bax因子表达而抑制结肠癌的增殖.

关键词: Dickkopf-1; p53; 结肠癌; 免疫印迹法

Anti-colon carcinoma mechanism of cloned Dickkopf-1

Jia-Chu Li, Yu-Ping Zuo, Yang Liu, Zhao-Chun Zeng

Jia-Chu Li, Yu-Ping Zuo, Yang Liu, Zhao-Chun Zeng, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Chongqing Medical University, Chongqing Biochemistry and Molecular Pharmacology Main Laboratory, Chongqing 400016, China

Correspondence to: Dr. Zhao-Chun Zeng, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Chongqing Medical University, Chongqing Biochemistry and Molecular Pharmacology Main Laboratory, 1 Medical Road, Yuzhong District, Chongqing 400016, China. zengzc88@yahoo.com.cn

Received: May 11, 2007
Revised: October 3, 2007
Accepted: November 25, 2007
Published online: January 8, 2008

Abstract

AIM: To clone the cDNA of Dickkopf-1 (Dkk1) and to investigate its anti-colon carcinoma activity.

METHODS: Dkk1 cDNA was retrived from Mouse Embryo 9 dpc, DH10B cDNA library, and eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) Dkk1 was constructed. Transfected CT26 colon carcinoma cells served as the experimental group, transfection empty vector pcDNA3.1(+) cells served as the empty vector group, and non-transfected cells as the non-transfected group. Proliferation of the CT26 colon carcinoma cells was measured by MTT assay. Expression of Dkk1, p53, Bcl-2 and Bax was detected by Western blotting.

RESULTS: Absorbance at 570 nm in the experimental group was lower than that in the empty vector and non-transfected groups (0.779 ± 0.025 vs 0.968 ± 0.016 and 0.973 ± 0.016, P < 0.05). Compared with the empty vector and non-transfected groups, the level of p53 and Bcl-2 in CT26 cells was lower, and the level of Dkk1 and Bax was higher.

CONCLUSION: Inhibition of CT26 cell proliferation by Dkk1 expression may be mediated by Dkk1 blocking mutant p53, decreasing Bcl-2 and enhancing Bax expression.

Key Words: Dickkopf-1; p53; Colorectal carcinoma; Western blotting

0 引言

结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一, 其发病机制并不完全清楚. Wnt信号的异常是导致恶性肿瘤的原因之一[1-2]. 脊椎动物的Dkk蛋白有Dkk1、Dkk2、Dkk3和Dkk4四种形式, 他们有较高同源性, 均抑制Wnt信号[3-4], 其中Dkk1作用最强[5], 在胚胎头颈形成起重要作用[6]. 哺乳动物的Dkk1含266个氨基酸残基, 在不同的肿瘤表达水平不同. 在人类胃肠道肿瘤中, DKK家族基因常常被后天灭活[7-8], Dkk1蛋白减少或缺失. Shou et al[9]在人胶质母细胞瘤U87MG细胞中, 也没有检测到Dkk1的表达. 而在肝癌[10-11]、黑色素瘤[12]、肺癌[13]Dkk1水平则增高. Mikheev et al[14]在HeLa细胞表达的外源Dkk1显著地抑制其在软琼脂上的生长, 其生长动力学参数在统计学上与HeLa细胞有显著差异. 如果将Dkk1基因转入U87MG细胞, 表达中等水平的Dkk1蛋白, 再用神经酰胺(ceramide)处理, 细胞则出现显著凋亡[9]. 两者均显示在Dkk1水平低下时, 表达外源性Dkk1可以抑制细胞生长, 促进细胞凋亡. 这可能是通过调节Wnt和p53信号而发挥作用的. p53能诱导Dkk1的表达[15-16], Dkk1蛋白能抑制Wnt信号, 增强p53对肿瘤生长的抑制作用. Gonzalez-Sancho et al[17]发现Dkk1启动子上有多个β-catenin/TCF4结合位点. 激活Wnt信号途径, 活性的β-catenin, TCF4或者LRP6突变体均可诱导人类Dkk1转录. 结肠癌细胞里缺失Dkk1或水平降低, Dkk1的表达起抑制肿瘤增殖的作用. 我们将考察Dkk1的抗结肠癌作用, 研究其可能的机制.

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌细胞HEPA1-6和结肠癌细胞CT26, 由重庆医科大学病理教研室惠赠, 用含100 mL/L小牛血清RPMI 1640(Gibco)培养基, 在37℃、50 mL/L CO₂培养箱中传代培养. 利用脂质体介导pcDNA3.1(+)Dkk1进行瞬时转染结肠癌细胞CT26, 转染后的细胞为实验组, 转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞和未转染的细胞作为对照组. mouse embryo 9 dpc, DH10B cDNA文库购自德国RZPD公司, 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ, T4 DNA连接酶、高保真Taq DNA聚合酶(TaKaRa)、质粒提取试剂盒(上海生工)、PCR产物回收纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒、低分子量蛋白质标准、TMB显色液(Tiangen)、Transfection转染试剂(天为时代公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT、百萃生物)、PVDF膜(北京中山). 一抗: 兔抗鼠、人的Dkk1, p53, Bcl-2, Bax(IgG Santa Clauz), 兔抗二抗(中杉金桥).

1.2 方法

根据Dkk1的DNA序列, 设计PCR引物如下, 上游引物: 5'-CGCCAAGCTTTTAGTGTCTCTGGCAGGTGTGGAGCCTAGAA-3', 在5'端引入HindⅢ酶切位点. 下游引物: 5'-ATAAGGATCCATGATGGTTGTGTGTGCAGCGGCAGCT-3', 在5'端引入了BamHⅠ酶切位点. 菌落PCR, 用牙签在mouse embryo 9 dpc, DH10B cDNA培养面上蘸一下后丢入LA培养基5 mL中, 在37℃剧烈震荡培养12-16 h后, 培养液浑浊时, 用接种环在含Amp 100 mg/L的LB培养基上划线, 37℃倒置培养16 h以后, 在培养板上随机挑取9个克隆做PCR并设立阴性对照. PCR反应参数如下: 94℃变性1 min, 50℃复性2 min, 72℃延伸2 min, 共30个循环. PCR产物用凝胶回收试剂盒纯化、测序确认后, T-A克隆入pGM-T载体, Amp筛选, BamHⅠ和HindⅢ双酶切, 琼脂糖电泳回收850 bp左右的小片段DNA, 亚克隆入BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1(+)真核表达质粒, 构成pcDNA3.1 Dkk1. 琼脂糖电泳, 回收重组载体pcDNA3.1 Dkk1, 酶切和PCR鉴定.

1.2.1 MTT实验: 用pcDNA3.1-Dkk1和pc DNA3.1(+)质粒在Lipofectamine^TM脂质体的介导下转染上述细胞. 以pEGFP-C1载体为报告基因监测转染结果. 取DNA 2 mg, Transfection 5 μL分别用无血清培养基稀释至250 μL. 用胰酶消化细胞, 取0.4×10⁶细胞与上述2种液体混合, 培养, G418筛选, 6 d后, 取4×10⁵细胞加入到96孔板中, 继续培养24 h后每孔加入MTT至终浓度50 mg/L, 37℃继续培养4 h, 吸出培养液, 每孔加入DMSO g/L 150 μL, 酶标仪上振荡10 min测定570 nm处吸光度. 细胞抑制率 = [pcDNA3.1(+)组A₅₇₀-pcDNA3.1-Dkk1组A₅₇₀]/pcDNA3.1(+)组A₅₇₀×100%.

1.2.2 Western blot分析: 提取各组细胞总蛋白, Lowry法测定蛋白含量, 取等量蛋白进行12% SDS-PAGE, 转PVDF膜, 30 g/L BSA/TBS溶液8 mL封闭, 洗膜3次, 将一抗(兔抗鼠、人p53, Bcl-2, Bax, Dkk1)分别以1∶1000适当稀释于5 g/L BSA/TBS中37℃孵育至少1 h, 弃去一抗用TBS洗2次, 每次10 min; 弃去TBS, 加入适当稀释1∶500于5 g/L BSA/TBS的二抗, 37℃孵育2 h; 弃去二抗, 用TBS洗膜30 min, 共3次, 显色.

2 结果

阴性对照管没有条带, 而1号管出现一条大小在800-900 bp间的条带, 符合Dkk1 cDNA大小, 测序后确认即为Dkk1 cDNA, 没有碱基突变(图1). 对pcDNA3.1(+) Dkk1进行PCR, 结果条带大小在800-900 bp之间, 与Dkk1 cDNA大小相符合(图2). HindⅢ和BamHⅠ双酶切pcDNA3.1(+) Dkk1载体, 产生两个片段. 大片段在4361-6557 bp之间, 与载体pcDNA3.1大小相符; 小片段与Dkk1 cDNA大小相符(图3).

图1 PCR扩增Dkk1 cDNA. 1: 菌液; 2: 阴性对照; M: 100 bp的DNA分子量标准.

图2 克隆的Dkk1 cDNA的鉴定. 右: 所提的质粒为模板, PCR所得到的目的条带(800-900 bp); 左: 100 bp DNA标准分子量.

图3 pcDNA3. 1(+) Dkk1双酶切鉴定. M: λ噬菌DNA HindⅢ酶切的Marker; 1: HindⅢ和BamHⅠ双酶切pcDNA3.1(+) Dkk1所得: 大片段为pcDNA3.1(+), 小片段为Dkk1.

2.1 MTT细胞增殖实验

用脂质体介导pcDNA 3.1(+) Dkk1瞬时转染结肠癌细胞CT26和表达Dkk1的肝癌细胞HEPA1-6(对照), MTT法检测细胞的增殖. CT26与对照组比较, 570 nm吸光度明显降低, 外源的Dkk1在CT26表达可以抑制其增殖, 抑制率约为20%. 而HEPA1-6细胞及其相应的对照在570 nm吸光度没有明显的变化(表1). t检验显示CT26实验组和对照组有显著性差异P<0.05, 其余各组间无显著性差异.

表1 外源表达Dkk1对细胞增殖的影响(mean±SD, n = 8).

	-	pcDNA3.1	pcDNA3.1Dkk1
CT26	0.973±0.016	0.968±0.016	0.779±0.025a
HEPA1-6	0.950±0.029	0.943±0.032	0.970±0.013

^aP <0.05 vs PCDNA3.1.

2.2 免疫印迹分析

实验组3相对于对照组1和2, 蛋白质p53和Bcl-2的量是少的, 而蛋白质Bax的量, 实验组相对于对照组来说是多的(图4).

图4 Western blot分析结肠癌CT26细胞总蛋白中的p53、Bcl-2、Bax蛋白水平. 1: 未转染; 2: 转染空载体; 3: 转染pcDNA3.1(+) Dkk1.

3 讨论

Dkk1在结肠癌细胞表达缺失, 是否起抑癌基因的作用尚待证实. 我们从mouse embryo 9 dpc, DH10B cDNA文库筛选出Dkk1 cDNA, 经测序确认后亚克隆入pcDNA3.1(+)构建了pcDNA3.1 Dkk1真核表达载体, 转染结肠癌细胞CT26, 用MTT法测570 nm吸光度, CT26pcDNA3.1 Dkk1组高于CT26pcDNA3.1(+)实验低于对照组, t检验有显著性差异. 表明外源的Dkk1在CT26表达可以抑制其增殖, 抑制率约为20%, 抑制率不太高, 可能与转染效率(约为28.3%)和抑制不具有放大作用有关. 而在肝癌细胞HEPA1-6, 表达外源的Dkk1不抑制其增殖. 免疫印吸分析细胞总蛋白中p53的含量, CT26、CT26pcDNA3.1(+)高于CT26pcDNA3.1 Dkk1(图4). Gonzalez-Sancho et al[17]发现在Dkk1启动子-2100位有一个p53响应元件, 野生p53蛋白与之特异结合, 促进Dkk1转录. 在CT26检测不到Dkk1, 可能是突变p53蛋白丧失诱导Dkk1转录的能力. 外源Dkk1基因在结肠癌细胞内的表达, 反馈抑制突变p53的表达, 致使其量减少, 肿瘤细胞的增殖受抑. 肿瘤既是细胞增殖和分化异常、也是细胞凋亡异常的疾病. Bcl-2家族基因参与细胞凋亡的调节, Bcl-2蛋白拮抗[18]、而Bax蛋白则促进细胞凋亡[19], 二者的作用相反. 细胞内的Bax和Bcl-2含量对比决定其生存与凋亡[20]. 我们发现CT26中Bax蛋白的量在pcDNA3.1(+)组要低于pcDNA3.1 Dkk1组, 而Bcl-2蛋白的量则是pcDNA3.1(+)组要高于pcDNA3.1 Dkk1组(图4), 表明在Dkk1抑制肿瘤细胞增殖时, 与Bax和Bcl-2蛋白作用有关. Dkk1蛋白在许多肿瘤中都存在. Wirths et al[11]指出, Dkk1在肝母细胞瘤(HBs)和Wilms瘤中表达升高, 这可能和Wnt信号失控有关, 高水平的Dkk1可作为HBs和Wilms瘤的一个标记. 在Dkk1表达降低或者缺失的肿瘤, 外源的Dkk1表达或许可以抑制肿瘤增殖. Suraweera et al[21]报道没有发现人结肠癌的Dkk1突变, 但Aguilera et al[7]发现Dkk1启动子的CpG岛甲基化导致转录沉默. 有趣的是Mueller et al[22]发现神经胶质瘤里Dkk1没有突变, 其转录也不受p53调节, 他不是该肿瘤的主要致病因素. 是否Dkk1蛋白也具有突变型和野生型? 如果有, 是否突变的蛋白具有致癌而野生型具有抑癌作用; Dkk1抑制结肠癌的机制以及Dkk1在胞内的作用等还有待于进一步的研究.

评论

背景资料

Wnt信号的转导由Wnt和Frizzled 受体结合引起, 需要低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/60)的参与. Dickkopf1 (Dkk1)通过两种途径抑制Wnt信号转导: 与LRP5/ 6结合, 阻断 Wnt信号; 与另一类跨膜蛋白Kremen1/2结合, 刺激LRP5/6内吞, 减少细胞膜上的LRP5/6, 进一步调节Wnt信号. Dkk1蛋白通过调节Wnt和p53信号促进肿瘤细胞凋亡.

研发前沿

肿瘤的基因治疗是手术、放射、化疗之后的新疗法. Dkk1在某些肿瘤细胞的低表达, 为导入外源Dkk1治疗这些肿瘤提供了前提条件. 研究Dkk1的细胞内水平的调控, 与其他信号途径的相互作用, 对细胞增值影响的机制, 获得相关的信息是当前的热点. 这为肿瘤Dkk1的基因治疗、研发与Dkk1相关的肿瘤治疗药物打下坚实的基础.

创新盘点

本文介绍了用MTT法显示外源Dkk1基因在CT26细胞的表达对细胞的增殖具有一定的抑制作用, 免疫印吸方法显示了在结肠癌CT26细胞中的Dkk1、Bax表达低于、Bcl-2、p53表达高于pcDNA3.1 (+)Dkk1转染的CT26细胞. 转染Dkk1后, p53水平降低. 推测外源Dkk1表达可反馈抑制突变的p53生成, 抑制癌细胞的增殖. 最近也报道Dkk1在某些肿瘤细胞的表达是低下的, 这不是突变引起的, 而是表达受阻, 原因在转录水平. 而在翻译水平抑制尚未见报道.

应用要点

Dkk1具有抑制肿瘤细胞增殖的作用, 但在某些肿瘤细胞的表达水平很低, 导入外源性Dkk1可以解决这一问题. 本课题已初步证实, Dkk1可以作为某些肿瘤基因治疗的目的基因.

同行评价

本文设计合理, 方法全面, 结果可信, 具有一定的科学性和研究价值.

备注

编辑:何燕 电编:何基才

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