PPARγ表达上调体外抑制肝星状细胞的增殖

摘要

目的: 研观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达上调对肝星状细胞增殖及凋亡的影响.

方法: 体外培养HSC-T6细胞, 取对数生长期的细胞, 应用1, 2, 3 μmo/L不同浓度的PPARγ激动剂15d-PGJ2作用24 h. 同时以不加药物只加无血清培养基作为对照组, 24 h后应用RT-PCR的方法观察分析各组间肝星状细胞PPARγ mRNA表达的变化, MTT检测HSC增殖, 流式细胞仪分析HSC-T6细胞凋亡.

结果: 经1, 2, 3 μmo/L 15d-PGJ2处理的HSC-6细胞中PPARγ mRNA表达比例上调(0.513±0.031, 0.697±0.018, 0.674±0.032 vs 0.198±0.021). MTT结果显示不同浓度的15d-PGJ2对HSC-T6细胞的增殖均有抑制作用, 以2 μmol/L

组最为显著(54.6%±11.1%). 流式细胞仪结果显示15d-PGJ2处理组凋亡细胞数明显增多.

结论: PPARγ表达上调能够抑制HSC-T6增殖并诱导其凋亡.

关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体γ; 肝星状细胞; 凋亡; 流式细胞仪

Inhibition of proliferation of hepatic stellate cells by up-regulation of peroxisome proliferator-activated receptor γ

Rui Chen, Sheng-Lan Yang

Rui Chen, Sheng-Lan Yang, Department of Chinese Traditional Medicine, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Correspondence to: Rui Chen, Department of Chinese Traditional Medicine, Huazhong University of Science and Technology, Jiefang Avenue, Wuhan 430022, Hubei Province, China. unioncr@hotmail.com

Received: March 19, 2007
Revised: November 15, 2007
Accepted: November 28, 2007
Published online: November 28, 2007

Abstract

AIM: To evaluate the effect of up-regulated expression of peroxisome proliferators-activated receptor (PPAR)γ on hepatic stellate cell (HSC) apoptosis and proliferation.

METHODS: The rat hepatic stellate cell line (HSC-T6) was cultured in DMEM, and treated with PPARγ agonist 1, 2, 3 μmol/L 15d-PGJ2 for 24 h. The proliferation rate for HSC-T6 cells was determined in 15d-PGJ2-treated and control groups by the MTT colorimetric assay. The cell cycle and apoptosis ratio were measured by flow cytometry.

RESULTS: The expression of PPARγ mRNA in HSC-T6 cells treated with 1, 2, 3 μmol/L 15d-PGJ2 was increased (0.513 ± 0.031, 0.697 ± 0.018, 0.674 ± 0.032 vs 0.198 ± 0.021), and the proliferation of HSC-T6 cells was significantly inhibited by 15d-PGJ2, especially at a concentration of 2 μmol/L (54.6% ± 11.1%). In addition, flow cytometry suggested that the apoptosis was significantly increased in HSC-T6 cells treated with 15d-PGJ2.

CONCLUSION: Up-regulated expression of PPARγ can inhibit proliferation and induce apoptosis of HSC cells.

Key Words: Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Hepatic stellate cell; Apoptosis; Flow cytometry

0 引言

肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理过程. 肝星状细胞的激活、增殖及细胞外基质的沉积是肝纤维化的重要环节. 近年有学者观察到肝纤维化组织中PPARγ表达明显下调, 与纤维化程度存在某种相关关系[1]. 目前已知PPARγ存在多种配体及激活物, 大致可分为合成型配体和天然型配体两大类. PPARγ的天然配体多为前列腺素代谢产物, 如PGD2, PGJ2, 15-deDxy-D12.14-PGJ2等. 另外, 不饱和脂肪酸、氧化低密度脂蛋白也可以作为PPARγ的天然配体, 发挥他们的生理作用[2]. 我们通过PPARγ的激动剂15d-PGJ2上调PPARγ表达观察其对HSC增殖凋亡的影响, 旨在探讨其对HSC增殖凋亡的调节机制, 为将来指导抗肝纤维化治疗提供实验基础.

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自上海中医药大学肝病研究所. PPARγ的激动剂15d-PGJ2为美国Caymen公司产品, 购自晶美公司,溶于二甲基亚砜, 并充入氮气于-20℃保存. 其余分生试剂均为Promega公司产品. 大鼠肝星状细胞株HSC-T6生长于体积分数为100 mL/L小牛血清及1×10⁵ U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液中, 在37℃, 50 mL/L CO₂、水饱和蒸汽的条件下进行培养. 分为对照组、15d-PGJ2处理组. 处理组加入浓度分别为1, 2, 3 μmol/L 15d-PGJ2, 以不加药物而加等体积的无血清培养基为对照组.

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测PPARγmRNA的表达: 各取1×10⁶细胞, 按TRIzol试剂盒说明书用一步法提取总RNA, 测定RNA的浓度及纯度. 逆转录反应条件参照试剂盒说明, 将逆转录产物5 μL加入PCR反应液中, PCR反应液如下: 10×buffer 5 μL, 25 mmol/L MgCl2 3 μL ,目的引物各2 μL, 10 mmol/L dNTP 1 μL, 用无菌水补足20 μL体积. PCR反应条件为95℃变性5 min后, 按95℃ 1 min变性, 55℃ 1 min退火, 72℃ 2 min延伸3步组成的32个循环, 最后72℃延伸10 min, 反应物经凝胶电泳检测. PPARγ的引物序列为上游引物: 5'-TGATATCG CCACTGGAACC-3', 下游引物: 5'-GTCCTCTCAGCTGTTCGCCA-3', β-actin 上游引物: 5'-ATCATGTTTGAGACCTTTCAACA-3', 下游引物: 5'-CACCTCTTTGCTCCGAAGTCCAA-3'. PCR反应产物10 μL凝胶电泳显像, 应用美国UVP公司的凝胶成像系统(GDAS-1200)行荧光灰度分析, 用β-actin作内参, 进行半定量分析.

1.2.2 MTT法检测细胞增殖: MTT试剂用PBS配成5 g/L的溶液, 过滤除菌备用. 取对数生长期的HSC-T6细胞, 用0.1 g/L EDTA消化后制成5×10⁸/L的细胞悬液, 以每孔200 μL接种于96孔平底培养板上, 置于37℃、50 mL/L CO₂及饱和湿度的培养箱中, 24 h后加入不同浓度的15d-PGJ2. 以不加药物而加等体积的无血清培养基为空白对照组. 每组设3个复孔, 分别于24, 48, 72 h时每孔加入5 g/L的MTT 10 μL, 并于37℃温育4 h后小心吸弃上清, 每孔加入10% DMSO 100 μL充分混匀, 用TRCAN酶标仪(American research公司产品)于570 nm处测吸光度值A值, 以3个复孔的平均A值为相应的A值. 抑制率(%) ＝ (空白孔平均A值-加药组平均A值)/空白孔平均A值×100%.

1.2.3 流式细胞仪检测15d-PGJ2对HSC-T6细胞凋亡的影响: 取对数生长期细胞, 加入不同浓度的15d-PGJ2. 以仅加入等体积的无血清培养基作为对照组. 作用48 h, 分别收集各组细胞. 每组设立3份标本重复, 具体实验步骤如下. 配置PI染液, 浓度为100 mg/L, 加入RNase100 mg/L, 4℃避光保存, 收集各组细胞2×10⁶/L, 500-1000 r/min, 5 min去上清, 磷酸盐缓冲液(PBS)3 mL洗涤1次, 将细胞团缓慢加入700 mL/L乙醇固定4 h, PBS洗去固定液, 400钼筛网过滤, 500-1000 r/min离心5 min去上清, 加入碘化丙锭(PI)染液混匀, 4ºC避光作用30 min, 用FACS400型流式细胞仪进行检测, 观察细胞凋亡情况.

2 结果

2.1 HSC-T6中PPARγmRNA的表达

对照组及不同浓度15d-PGJ2作用组细胞中均有PPARγmRNA的表达. 随着15d-PGJ2作用浓度的增加, PPARγmRNA表达增强, A值分别为0.513±0.031, 0.697±0.018, 0.674±0.032. 且同对照组(A值为0.198±0.021)相比, 经方差分析检验, 差异性有显著性意义(图1).

图1 RT-PCR检测HSC-T6中PPARγ mRNA的表达. M: marker; 1: 对照组; 2-4: 1, 2, 3 μmol/L 15d-PGJ2.

2.2 15d-PGJ2对HSC-T6细胞增殖的影响

48 h时1, 2, 3 μmol/L 15d-PGJ2对HSC-T6细胞增殖的抑制率分别为24.3%±8.3%, 54.6%±11.1%, 57.2%±16.8%. 2 μmol/L 15d-PGJ2的浓度即出现较明显的抑制作用. 与3 μmol/L 15d-PGJ2相比, 其抑制率并没有显著性差异(P>0.05), 表明剂量加大并不能明显增加抑制作用. 同时观察到抑制率也呈现出一定的时间依赖性, 15d-PGJ2处理组细胞在24 h后增殖速度即开始减缓, 48 h抑制率达高峰(表1).

表1 MTT法检测15d-PGJ2对HSC-T6增殖的抑制作用 (mean±SD, %).

t/h	15d-PGJ2处理组(μmol/L)
	1	2	3
24	8.7±1.7	15.4±6.2a	17.6±3.1a
48	24.3±8.3	54.6±11.1a	57.2±16.8a
72	21.5±6.7	50.2±10.5a	51.6±13.2a

^aP<0.05 vs 1 μmol/L 15d-PGJ2处理组.

2.3 15d-PGJ2对HSC-T6细胞凋亡的影响

15d-PGJ2处理组细胞在G1峰左侧均有一凋亡峰, 分别有12.32%±1.24%, 30.74%±6.09%, 30.56%±5.44%的细胞凋亡. 而对照组细胞此凋亡峰不明显, 仅有3.36%±1.87%的细胞产生凋亡, 差异有显著性意义(P<0.05, 图2).

图2 流式细胞仪检测15d-PGJ2对HSC-T6细胞凋亡的影响. A: 对照组; B-D: 1, 2, 3 μmol/L 15d-PGJ2处理组.

3 讨论

细胞凋亡是机体内细胞生理性的调节机制, 通过凋亡清除多余和有害的细胞, 与细胞分裂增殖一起调控组织器官的细胞数目, 保证机体的正常发育. 研究发现, 在肝纤维化进展过程中HSC有丝分裂及凋亡均增加, 但以增殖为主. 而在逆转阶段凋亡占优势, 使HSC失去净增加, HSC凋亡与转化激活状态密切相关. 对这一过程的调控机制尚无一致的定论[3]. 近年来对肝纤维化形成的机制的研究取得了令人鼓舞的进展. 越来越多的临床及实验证据表明, 肝纤维化是可逆转的病变, 这一观点逐渐被广泛接受. 肝星状细胞的激活是肝纤维化形成的中心环节, HSC在肝纤维化逆转过程中的作用亦成为研究的热点. HSC激活后大量增殖, 并可以自分泌的方式维持这种增殖与活化的持续. 那么, 活化的HSC命运如何, 是否从激活状态转变为静止的状态? 是否通过死亡或凋亡的方式减少数量, 从而使肝纤维化逐渐被吸收, 病理过程发生逆转? 这些问题一直是目前研究的关注焦点之一. 有学者认为, 肝纤维化逆转时HSC的减少是由于激活状态的HSC转化为静止状态[3]. 但最新研究表明, 肝纤维化恢复期, 激活状态的HSC主要是通过凋亡机制, 而不是表型的转化[4]. 了解HSC凋亡的机制, 并通过一定方式诱导活化的HSC凋亡, 在肝纤维化发生机制与治疗中具有重要意义.

已知PPARγ在脂肪组织中高表达, 主要参与脂质代谢. 近来发现PPARγ在多种组织中都有表达, 不仅参与炎症过程, 还可调节细胞增殖分化,在肿瘤细胞的凋亡机制中亦发挥一定作用. 我们利用配体激动剂15d-PGJ2上调HSC中PPARγ的表达, 发现随着PPARγ的表达上调, HSC细胞增殖速度减慢, PPARγ对HSC的增殖速度影响有一定的剂量依赖和时间依赖性, 在2 μmol/L 15d-PGJ2浓度下即可发挥最大抑制效应. 抑制作用发挥亦有一定的时间限制性, 在48 h时抑制作用最为显著. 研究表明, 在持续纤维化肝损伤过程中HSC有丝分裂及凋亡均增加, 但增殖占优势, 故而使纤维化程度不断加剧. 而在肝纤维化逆转阶段, HSC凋亡占优势, 活化HSC绝对数量减少, 故而诱导HSC凋亡成为抗肝纤维化治疗的一种新策略[5]. 目前关于HSC凋亡机制尚未完全清楚. TNF-α, 胰岛素样生长因子-1, TGF-β等多种细胞因子都参与此过程[6]. 有学者发现Fas途径可诱导体外培养的HSC凋亡, 也有学者认为, 随着HSC的激活进程P53基因不断增加, 可能参与HSC的凋亡过程[7-8]. 除了上述凋亡调节基因的作用外, TNF-α对激活的HSC可产生凋亡诱导作用, 此作用可被转录因子NFκB所阻断[9]. 我们采用流式细胞仪的方法, 针对PPARγ表达上调后是否诱导HSC凋亡进行了进一步的研究. 结果表明随着PPARγ表达的上调, HSC凋亡率逐渐增加, 表明PPARγ一方面抑制HSC增殖; 另一方面诱导其凋亡, 从而发挥抗纤维化的作用. 这就为我们进一步进行抗纤维化治疗提供了新的切入点.

评论

背景资料

肝星状细胞的激活、增殖及细胞外基质的沉积是肝纤维化的重要环节. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属核激素受体超家族成员之一, 是配体依赖性激活的核转录因子. 目前已知PPARγ存在多种配体及激活物,参与细胞增殖以及脂质代谢, 免疫炎症因子激活等生理调控机制.

相关报道

有报道肝纤维化组织中PPARγ表达明显下调, 与纤维化程度存在某种相关关系. 越来越多证据表明PPARγ在肝脏代谢功能方面发挥重要调节作用, 其功能改变与一些肝脏疾病的发生发展显示有某种相关性.

应用要点

本文通过PPARγ的激动剂15d-PGJ2上调PPARγ表达观察对HSC增殖凋亡的影响, 旨在探讨对HSC增殖凋亡的调节机制, 为将来指导抗肝纤维化治疗提供实验基础.

同行评价

本文选题新颖, 观察指标较系统, 结论明确, 具有很强的学术价值和临床研究意义.

备注

编辑:何燕 电编:李海寅

参考文献

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