遗传性胰腺炎胰蛋白酶原基因突变分析

摘要

目的: 分析胰蛋白酶原基因(cationic tryp-sinogen, PRSS1)在遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis, HP)患者中突变的性质.

方法: 用基因产物直接测序法对1个遗传性胰腺炎家系中的胰腺炎患者(共有2例成员)的PRSS1基因5个外显子进行测序, 并分析其临床特征.

结果: 在2例胰腺炎患者中均出现了PRSS1基因3号外显子纯合子突变(c.415 T>A), 表达的氨基酸从胱氨酸(Cys)→丝氨酸(Ser), 平均发病年龄为16岁, 家系中胰腺炎患者的血清肿瘤标志物均正常.

结论: PRSS1基因3号外显子c.415 T>A突变与遗传性胰腺炎有关.

关键词: 遗传性胰腺炎; PRSS1基因突变; 临床特征

Mutations of the cationic trypsinogen gene in patients with hereditary pancreatitis

Qi-Cai Liu, Feng Gao, You-Shi Xu, Feng-Qing Wang, Yun-Zhen Pan, Qi-Shui Ou

Qi-Cai Liu, You-Shi Xu, Feng-Qing Wang, Yun-Zhen Pan, Qi-Shui Ou, Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China

Feng Gao, Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China

Correspondence to: Dr. Qi-Shui Ou, Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 20 Chazhong Road, Fuzhou 350005, Fujian Province, China. lqc673@yahoo.com.cn

Received: June 7, 2007
Revised: September 25, 2007
Accepted: September 28, 2007
Published online: November 28, 2007

Abstract

AIM: To identify the mutation character of cationic trypsin gene (PRSS1) in the patients of hereditary pancreatitis (HP).

METHODS: Two Patients with hereditary pancreatitis, five exons of PRSS1 gene were amplified by PCR and it's products were analyzed by sequencing, related clinical data were also collected.

RESULTS: Two patients of the HP families were found c.415 T > A mutation. It's members showed symptom about 16 years old.

CONCLUSION: PRSS1 gene c.415 T >A mutation may be an factor associated with hereditary pancreatitis.

Key Words: Hereditary pancreatitis; Mutation of PRSS1; Characterization

0 引言

遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis, HP)是一种罕见的疾病, 约占胰腺炎总数的1%, 于1952年由Comfort和Stein-berg发现并确立的一种独立的疾病[1-3]. HP是常染色体显性遗传疾病, 有80%的表型外显率, 见于不同人种, 男女发病几率相等. 目前没有证据表明其和特殊的HLA系耦联. HP患者有45%的机会可发展为胰腺癌. 两个独立的大型流行病学研究(国际遗传性胰腺炎研究小组和欧洲胰腺癌和遗传性胰腺炎登记处)发现HP发生胰腺癌的危险性增加了将近50-70倍[4-8]. 近年来有关HP的相关研究已深入开展, 至今已经在60%-70%的家族中发现了胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen gene, PRSS1)两个不同的突变即R122H和N29I[1]. 为了明确PRSS1基因在中国HP家系中的突变情况, 本研究对一个HP家系的胰腺炎患者进行PRSS1基因的5个外显子全长测序如下.

1 材料和方法

1.1 材料

家系2: 含3代14个成员(图1). 胰腺炎2例, 分别为Ⅲ5、Ⅲ6. 先证者(Ⅲ6), 女, 28岁, 14岁时胰腺炎第1次发病, 先后6次住院均确诊为胰腺炎.

图1 胰腺炎患者家系图. ↗: 先证者; ●: 胰腺炎患者; ○: 正常人.

1.2 方法

经同意后, 取家系中胰腺炎患者的外周血2 mL, EDTA抗凝, 用Wizard^®Genomic DNA Purification Kit(promega公司)提取DNA, 按使用说明书操作. 应用Primer Express软件自行设计引物, 上游引物: 5'-ggtcctgggtctcatacctt-3'; 下游引物: 5'-gggtaggaggcttcacactt-3'(由上海生工生物技术公司合成), 该引物扩增产物长度为818 bp. PCR反应体积为50 μL, 含50 ng样品DNA, 0.06 mol/L引物, 0.2 mmol/L dNTP, 10×PCR缓冲液2.5 μL, 2.0 mmol/L Mg²⁺, 1 U Taq酶(Promega公司). 在PE9700热循环仪上94ºC 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s, 循环35次, 72℃延长7 min. 琼脂糖凝胶电泳, 观察结果. PCR产物使用Tiangen公司胶回收试剂盒, 按使用说明操作, 回收产物. PCR产物直接测序由上海生工生物技术公司完成. 另收集记录家系成员的其他临床一般资料(年龄、性别、发病年龄、病程、家族史、并发症以及治疗情况).

2 结果

2.1 基因测序

胰腺炎患者Ⅲ5, Ⅲ6的PRSS1基因测序图与NCBI公布的标准序列比对可见3号外显子第415位碱基发生T→A突变(图2)

图2 家系2胰腺炎患者的PRSS1基因测序图. 突变的结果: Cys139 (胱氨酸) PRSS1wt 5'...G AAG TGC CTC...3', Ser139 (丝氨酸) T→A 5'...G AAG AGC CTC...3'. A: 胰腺炎患者的正向测序图; B: 正常对照者的PRSS1基因测序图.

2.2 PRSS1基因Swiss-Model模拟的三维结构

家系中患者PRSS1基因突变后的胰蛋白酶原空间三维结构与国际上报道的R122H相似(图3).

图3 基于Swiss-Model的胰蛋白酶原蛋白空间结构. A: T→A突变后的PRSS1胰蛋白酶原构像; B: R→C突变后的PRSS1胰蛋白酶原构像(国际上通常报道的R122H); C: 正常的PRSS1胰蛋白酶原构像.

2.3 氨基酸序列和临床资料

遗传性胰腺炎患者PRSS1基因突变将引起的氨基酸序列改变如下: MNPLLILTFVAAALAAPFDDDDKIVGGYNCEENSVVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYKSRIQVRL GEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINARVSTISLPTAPPATGTK C/S LISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPGKITSNMFCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGQLQGV VSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANS. 遗传性胰腺炎患者的血液生化改变情况见表1.

表1 遗传性胰腺炎患者的血液生化改变情况.

病例	空腹血糖 (mmol/L)	GHb (%)	乳酸 (mmol/)	胱抑制素 C(mmol/L)	CA19-9 (mmol/L)
Ⅲ5	5.32	3.69	3.22	1.06	15.3
Ⅲ6	4.98	4.23	2.26	1.15	22.1
参考范围	3.89-6.11	3.8-5.8	1.0-2.1	0.34-1.70	0-27

3 讨论

1996年Whitcomb et al[9-13]在遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis, HP)患者中发现, 与之相关联的第7号染色体长臂(7q35)上的胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen, PRSS1)发生突变与HP发病相关(阳离子胰蛋白酶原所起的作用是水解食物中含有赖-精氨酸残基的蛋白质, 同时他在激活/灭活其他消化酶的过程中起关键的作用), 对PRSS1基因的深入研究可为HP的分子病理学解析提供新线索. 据报道HP发生胰腺癌的机率比正常人高53倍[14-16]. 至今已经在60%-70%的家族中发现了阳离子胰蛋白酶原基因常见的2种突变即R122H(密码子122, 外显子3, 精氨酸→组氨酸)和N29I(密码子29, 外显子2, 精氨酸→组氨酸)[17-19]. 其中, 以R122H最为常见. R122H突变可使蛋白质对胰蛋白酶的裂解呈抗性, 结果是蛋白质自我激活, 伴有蛋白水解酶胰蛋白酶在细胞内的不恰当积聚, 导致胰腺组织本身的消化[6,20-23].

我们通过分析遗传性胰腺炎家系发现他们具有以下特征: (1)呈常染色体显性遗传, 家系中均存在男女患者; (2)患者的肿瘤标志物水平不增高; (3)不表现出糖尿病症状. 进一步分析家系的PRSS1基因突变情况发现家系胰蛋白酶原基因3号外显子415位碱基存在T→A纯合子突变, 表达的氨基酸从胱氨酸(Cys)→丝氨酸(Ser), 与国际上报道的R122H突变在同一外显子[3,8]. 三维构像与R122H相似, 突变改变识别位点, 不改变胰蛋白酶原的三级结构, 也不改变其催化活性; 在三维立体构像中的精氨酸位于胰蛋白酶催化活性部位及其抑制物结合位点的背面, 本家系发病年龄与参考文献[24-29]相当. 另外, 本家系目前未发现糖尿病和胰腺癌患者, 可能与基因突变引起的临床表型不同有关, 我们将做进一步分析.

HP患者的PRSS1基因存在多种形式的突变, 且与临床表型相关, 对PRSS1基因的深入研究可为探讨胰腺炎的发病机制提供新的线索.

评论

背景资料

遗传性胰腺炎占胰腺炎的1%左右, 是常染色体显性遗传疾病, 有80%的表型外显率, 主要由胰蛋白酶原基因突变引起, 患者罹患胰腺癌的风险较正常人群高50多倍, 多伴有糖尿病.

相关报道

1996年Whitcomb et al发现遗传性胰腺炎患者中, 与之相关联的第7号染色体长臂(7q35)上的胰蛋白酶原基因发生突变与其发病相关(阳离子胰蛋白酶原所起的作用是水解食物中含有赖-精氨酸残基的蛋白质, 同时他在激活/灭活其他消化酶的过程中起着关键的作用), 对胰腺炎发病的分子病理学解析提供了新线索, 据报道HP发生胰腺癌的几率比正常人高出53倍. 至今已经在60%-70%的家族中发现了阳离子胰蛋白酶原基因常见的2种突变即R122H(密码子122, 外显子3, 精氨酸→组氨酸)和N29I(密码子29, 外显子2, 精氨酸 →组氨酸), 其中以R122H最为常见.

创新盘点

在国内首次用分子生物学技术对胰蛋白酶原基因在中国遗传性胰腺炎家系中突变情况做详细的分析.

应用要点

由于胰蛋白酶原基因突变在本文研究中主要表现为纯合突变, 患者的症状不如文献报道的典型, 无糖尿病、胰腺癌倾向, 新发现的突变形式将对药物开发提供新的线索.

同行评价

本文选题紧密结合临床, 方法先进, 结果可信, 图文并茂, 文笔流畅, 讨论客观. 对于丰富遗传性胰腺炎发病机制的认识, 具有重要的指导价值.

备注

编辑:何燕 电编:郭海丽

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