医用三氧与中药对醋氨酚犬中毒性肝炎的保护作用

摘要

目的: 探讨中药护肝方与医用三氧对醋氨酚犬急性中毒性肝衰竭的预防性保护作用.

方法: 健康杂种犬18只, 随机平均分为模型对照组, 中药预处理组和医用三氧预处理组. 处理15 d后各组均进行醋氨酚皮下注射, 分别于注射前、注射后24, 48, 72, 96 h及7, 14 d抽血检测肝功能、凝血酶原时间(PT)、血氨(AMMO)、尿素氮(BUN), 观察记录全身情况, 实验狗死亡时或治疗后存活14 d时取肝组织做病理观察.

结果: 与模型对照组相比, 中药组和三氧组的肝组织病理变化程度轻、病灶范围小, 肝细胞气球样变和脂肪变性明显. 三氧组与中药组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、AMMO、PT均显著低于模型对照组(P<0.05或0.01), 并且三氧组与中药组相比也有显著差异(P<0.05或0.01).

结论: 中药护肝方与医用三氧的预防性给药能够有效减轻醋氨酚所致犬急性中毒性肝损害, 降低血氨和缩短PT, 且医用三氧效果优于护肝方.

关键词: 药物性肝炎; 肝衰竭; 医用三氧; 中药; 醋氨酚

Protective effect of medical ozone and Chinese medicine on acetaminophen-induced toxic hepatitis in dogs

Di Huo, Yun-Gao Yang, Fei-Jian Ao, Wei Dai, Li-Jie Li, Ya-Bing Guo

Di Huo, Yun-Gao Yang, Li-Jie Li, Department of Chinese Medicine Clinical Basis, College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Fei-Jian Ao, Wei Dai, Department of Infectious Diseases, Shenzhen Donghu Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China

Ya-Bing Guo, Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Supported by: the Subject of Nanfang Hospital of Southern Medical University, No. 20050012, and the Foundation of Shenzhen Science and Technology Bureau of Guangdong Province, No. 200204182.

Correspondence to: Ya-Bing Guo, Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China. yabing@fimmu.com

Received: October 18, 2006
Revised: November 1, 2006
Accepted: November 16, 2006
Published online: January 28, 2007

Abstract

AIM: To investigate the protective effects of Chinese medicine Hugan recipe and medical ozone on acetaminophen-induced acute toxic hepatic failure in dogs.

METHODS: Eighteen mongrel dogs were averagely randomized into model control group, Chinese medicine (using Hugan recipe) pretreatment group and medical ozone pretreatment group. All the dogs were subcutaneously injected with acetaminophen to establish the models of acute toxic hepatic failure 15 days after pretreatment. Blood samples were collected for the detection of liver function, prothrombin time (PT), and the levels of ammonia and blood urea nitrogen (BUN) before and 24, 48, 72, 96 hours, 7, and 14 days after injection. The pathological changes of liver tissues were observed 14 days after injection.

RESULTS: The pathological changes such as ballooning and fat-like degeneration of hepatocytes were remarkably alleviated in Chinese medicine group and medical ozone group. The levels of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total bilirubin (TBIL), ammonia, and PT were significantly lower in Chinese medicine group and medical ozone group that those in control group (P < 0.05 or P < 0.01), and there were also notable difference between Chinese medicine group and medical ozone group (P < 0.05 or P < 0.01).

CONCLUSION: Preconditioning of medical ozone and Hugan recipe can protect liver against acute injury induced by acetaminophen in dogs, and the latter is superior to the former.

Key Words: Drug-induced hepatitis; Liver failure; Medical ozone; Chinese medicine; Acetaminophen

0 引言

尽管药物性肝炎问题日益突出, 但迄今尚无预防药物性肝炎的有效方法. 医用三氧具有其特殊生物药理学特点, 近年已应用于肝病治疗及免疫调节治疗[1-8]. 本文尝试应用中药护肝方及医用三氧, 对急性中毒性肝衰竭犬的预防性治疗作用进行初步探索.

1 材料和方法

1.1 材料

健康杂种犬18只, 体质量12.5-15 kg, 购自南方医院动物实验所. 动物实验遵守南方医科大学动物实验规则进行. 医用三氧由医用纯氧经过三氧发生器(德国哈斯乐Ozonosan alpha Plus 1107)制备, 是纯氧与三氧的混合气体. 本研究用三氧浓度为20 mg/L. 中药护肝方组成: 黄芪30 g, 党参20 g, 白术20 g, 生地黄15 g, 熟地黄15 g, 丹参15 g, 白花蛇舌草10 g, 板蓝根10 g, 上述药物水煎煮2次, 过滤制成1 kg/L生药药液. 醋氨酚(C₈H₉NO₂)由德国Fluka公司生产; 二甲基亚砜(C₂H₆OS)由广州新成精细化工厂生产.

1.2 方法

健康杂种犬18只, 随机分为3组, 分别是模型对照组, 中药组和医用三氧组, 每组6只. 中药组护肝方直肠灌药, 每只犬按4.14 g/kg剂量, 1次/d, 三氧组予医用三氧直肠灌注, 每次150 mL, 1次/d, 共15 d. 然后3组犬同时进行醋氨酚皮下注射. 醋氨酚注射方法是将醋氨酚溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成600 g/L的浓度[6], 新鲜配制使用. 用配制好的醋氨酚溶液采用多点皮下注射: 首次剂量为750 mg/kg体质量, 首次注射后9 h和24 h分别进行第2次和第3次注射, 用量均为200 mg/kg体质量. 观察犬的精神, 饮食, 行动, 大小便等. 于醋氨酚造模前及造模后24, 48, 72, 96 h, 7, 14 d抽血化验检测肝功能(ALT, AST, TBIL)、血氨(AMMO)、凝血酶原时间(PT)、尿素氮(BUN). 实验犬在实验前以及醋氨酚注射后死亡时或存活14 d时, 用肝组织活检枪取肝脏组织, 用40 g/L甲醛溶液固定, 石蜡包埋切片, 进行HE及嗜银染色, 光镜下观察.

统计学处理 用SPSS13.0版处理, 各数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 多个样本均数间的比较用方差分析(One-Way ANOVA); 多重比较满足方差齐性要求(P>0.05)的比较用LSD法分析, 不满足方差齐性要求(P<0.05)的比较用Tamhane法分析.

2 结果

各组犬醋氨酚造模前精神良好, 呼吸平稳, 饮食及二便正常, 对外界刺激反应灵敏. 造模后, 各组犬均表现为不同程度的精神困倦, 巩膜黄染, 摄食量减少, 呕吐, 小便黄, 日渐消瘦; 有些犬出现烦躁, 醉酒样步态; 有些犬精神萎靡, 嗜睡, 对外界刺激反应迟钝, 伤口难以止血. 以上表现在首剂醋氨酚注射后48-72 h最为明显, 且模型对照组最为严重.

2.1 生存期比较

醋氨酚模型对照组2只犬在造模后48 h出现呼吸困难, 昏睡, 渐至昏迷, 最终分别在造模后56, 75 h左右死亡, 本组其余犬及中药组与三氧组犬造模后14 d仍存活.

2.2 生化指标分析

模型对照组ALT, AST, TBIL, PT指标在注射醋氨酚造模后24 h即升高, 72 h时达高峰; AMMO在造模后48 h达高峰; BUN在造模后24 h达高峰(表1).

表1 各组肝功能和PT, AMMO, BUN的比较 (mean±SD, n = 6).

	ALT (nkat/L)	AST (nkat/L)	TBIL (mmol/L)	PT (s)	AMMO (mmol/L)	BUN (mmol/L)
模型对照组
造模前	441.76±150.20	522.27±94.19	3.32±0.44	7.30±0.28	35.82±7.47	3.53±0.56
造模后24 h	1755.85±315.40	1133.56±296.56	6.45±2.88	7.87±0.64	76.82±11.77	9.92±3.29
造模后48 h	3628.56±1570.81	1350.27±815.00	12.72±5.77	11.40±1.05	118.00±30.56	7.43±3.77
造模后72 h	4177.50±1289.76	3100.62±1150.06	24.28±7.70	12.74±1.83	91.38±26.05	4.36±2.35
造模后96 h	4192.51±1068.38	1541.98±207.54	22.45±5.12	11.00±1.13	84.30±11.56	3.35±0.96
造模后7 d	1979.56±223.38	1254.42±165.20	19.28±11.71	7.85±0.54	71.08±7.98	3.30±0.81
造模后14 d	1687.84±412.75	795.99±158.37	15.78±14.77	7.55±0.31	75.20±7.91	3.15±1.34
中药组
造模前	491.77±50.34	536.27±82.68	3.58±0.29	7.35±0.27	32.98±5.22	3.13±0.72
造模后24 h	1144.73±317.90b	1072.38±220.54	2.95±1.60b	7.95±0.58	65.58±8.62a	7.00±1.39
造模后48 h	1400.28±389.08	1203.07±260.05	6.07±2.86	9.02±0.52b	81.40±15.13	5.53±1.91
造模后72 h	1525.31±503.77a	950.19±188.37	4.87±3.25a	9.02±0.67a	71.83±15.18a	4.62±1.05
造模后96 h	811.33±237.71a	989.03±259.05b	6.78±1.64a	8.15±0.86a	62.07±7.48b	3.70±0.56
造模后7 d	1169.73±291.39b	944.69±221.88a	5.93±1.15	7.77±0.43	59.57±8.36a	3.35±0.44
造模后14 d	1036.37±329.57	588.95±131.19a	6.37±1.97	7.58±0.31	64.28±8.59a	3.22±1.10
三氧组
造模前	427.92±128.53	547.28±183.70	3.60±0.42	7.52±0.39	38.43±13.15	2.97±0.73
造模后24 h	1178.07±214.21b	991.87±468.26	2.22±1.33b	7.53±0.50	47.62±8.30bd	3.22±1.12ad
造模后48 h	991.87±345.90a	930.69±303.23	2.18±1.90a	7.75±0.67bc	53.48±10.19ac 3.57±0.80
造模后72 h	1055.71±316.23a	686.30±295.23a	2.52±1.87a	7.62±0.58ac	60.12±5.97b	3.77±0.93
造模后96 h	811.33±235.21a	822.33±319.56b	3.08±1.11ad	7.28±0.12a	51.48±17.12b	3.75±0.44
造模后7 d	622.29±159.37bd	702.97±207.04bc	2.65±0.79d	7.28±0.51	56.35±8.82b	2.78±0.87
造模后14 d	458.43±120.52ac	466.76±129.53b	3.22±0.84	7.32±0.26	60.33±3.55b	2.43±1.11

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 模型对照组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 中药组.

与模型对照组比较: 三氧组和中药组ALT明显低于模型对照组(三氧组在造模后24, 48, 72, 96 h, 7, 14 d; 中药组造模后24, 72, 96 h, 7 d), 有显著性差异(P<0.05或0.01); 同样三氧组和中药组AST, TBIL, AMMO升高也较模型对照组低, 有显著性意义(P<0.05或0.01). 三氧组和中药组PT值在造模后48, 72, 96 h比模型对照组低, 有显著性差异; 三氧组BUN造模后24 h显示出明显低于模型对照组, 有显著性差异(表1).

三氧组与中药组相比, 造模后7, 14 d ALT明显低于中药组, 有显著性差异; 三氧组造模后7 d时AST也明显较低; 造模后96 h, 7 d, 三氧组TBIL明显较低; 三氧组PT明显短于中药组(造模后48 h, 72 d); 三氧组AMMO明显较低(造模后24 h, 48 h); 三氧组BUN明显低有显著性意义(造模后24 h)(表1).

2.3 肝脏形态学观察

肉眼观: 正常犬肝脏呈红褐色、质软而脆. 模型对照组注药造模后肝脏体积缩小, 肝表面有块状瘀斑, 包膜皱缩, 有腹水, 肠系膜静脉和胃底静脉曲张. 中药组及三氧组的肝脏体积缩小不明显, 瘀斑少, 包膜完好.

显微镜下检查: 正常犬肝小叶结构完整, 肝细胞呈索状排列, 形态正常. 注药造模后14 d, 模型对照组肝索紊乱, 汇管区胆管增生, 肝细胞呈弥漫性浊肿, 片状坏死、嗜酸性变、肝内淤胆, 部分区域肝窦扩张, 充血, 汇管区炎性细胞浸润. 与模型对照组相比, 中药组和三氧组的肝组织病理变化程度轻、病灶范围小, 肝细胞气球样变和脂肪变性明显(图1).

图1 各组犬肝组织的显微镜检查(HE×200). A: 正常犬; B: 模型对照组醋氨酚中毒犬; C: 中药组醋氨酚中毒犬; D: 三氧组醋氨酚中毒犬肝组织.

3 讨论

本实验采用醋氨酚多点皮下注射法建立犬急性中毒性肝衰竭模型[6], 其作用机制为过量的醋氨酚由P450混合功能氧化酶转化为N2乙酰2苯醌亚胺, 苯醌亚胺可使血红蛋白氧化成三价铁的高铁血红蛋白, 在此过程中, 生成大量的氧自由基. 同时, 胺类和醌类化合物也能间接和直接产生超氧阴离子. 因此认为醋氨酚犬急性中毒性肝衰竭主要为氧自由基导致[7]. 醋氨酚犬中毒主要表现为嗜睡或烦躁、摄食量减少、呕吐、黄疸、伤口出血难止等肝严重损害(肝衰竭)表现. 以上表现及血液指标变化在第一次注射后48-72 h最为明显. 中药组尤其是医用三氧组在该段时间血液指标显示出明确的保护作用.

医用三氧应用于疾病治疗已有近50年历史[8]. 随着对三氧的作用机制研究积累, 现已部分明确了三氧具有某些特殊的生物学与药理学特性[1-5]: (1)增加红细胞代谢, 改善微循环; (2)作为强氧化物可诱导激活组织细胞产生抗氧化酶, 增强组织细胞清除自由基的能力; (3)低浓度三氧具有免疫激活和调节活性. 近年医用三氧已应用于肝炎和自身免疫性疾病的治疗尝试. 本动物实验显示, 三氧能有效地减轻实验犬肝功能损害程度. 推测其作用是三氧通过直肠吸收经门脉到肝脏和肾脏等组织器官, 改善组织器官的微循环, 激活组织细胞产生抗氧化酶系统, 例如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、过氧化氢酶等, 使组织细胞清除氧自由基能力增强, 抵抗醋氨酚肝肾组织毒性, 显示出减轻醋氨酚肝肾损伤作用.

护肝方是经验方, 方中甘微温之黄芪为主药, 补中益气, 党参补气生津养血, 白术补气健脾燥湿, 与黄芪相配, 加强补脾益气之功, 甘苦寒之生地黄清热凉血, 养阴生津, 甘微温之熟地黄补血滋阴, 益精填髓, 丹参活血凉血, 白花蛇舌草与板蓝根清热解毒. 八药相配, 共奏益气解毒, 凉血活血之功效, 其组方依据符合中医对肝衰竭热瘀相搏本质的认识[9-11]. 实验显示本方对肝脏具有良好的预防性保护作用, 能够有效减轻醋氨酚所致犬急性中毒性肝衰竭的肝功能损害, 降低血氨和缩短PT.

在中药给药方式上, 本实验中药采用灌肠给药, 由于直肠静脉通过门静脉进入肝脏, 药物不经胃酸及消化酶破坏, 同时可避免药物久服败胃的缺点[12], 避免加重上消化道症状.

当前药物性肝炎的治疗主要是祛除病因治疗, 即停用肝损害药物, 并施以"保肝"治疗药物(多为中药提取物、中成药[10,13-14]或还原型谷胱甘肽制剂[15]). 但是, 临床实践中很多情况下例如肿瘤化疗、器官移植后的免疫抑制等药物, 即使出现肝损害也是不能停用这些损肝药物的. 此种情况下, 就须考虑寻找能够预防药物性肝损害的方法. 当前大量"保肝"治疗药物并不具备预防性应用肝脏保护作用. 本动物实验结果显示, 医用三氧及中药护肝方直肠灌注应用能够预防某些药物性肝损伤, 为其临床预防应用提供了实验依据. 医用三氧及中药护肝方有可能成为预防药物性肝炎的新方法. 临床疗效有待在临床试验研究中证实.

评论

背景资料

药物性肝炎问题日益突出, 但迄今尚无预防药物性肝炎的有效方法. 临床实践中很多情况下根据病情需要祛除病因治疗无法实现, “保肝”治疗药物并不具备预防性应用肝脏保护作用. 医用三氧具有其特殊生物药理学特点, 近年已应用于肝病治疗及免疫调节治疗. 本文尝试应用医用三氧及中药护肝方, 对急性中毒性肝衰竭犬的预防性治疗作用进行初步探索.

研发前沿

目前对于医用三氧的基础研究主要集中在生物学与药理学特性方面, 其作用机制有一部分也只是一种推想, 并未得到实验证明, 在临床研究方面尚缺乏有力的循证医学证据来确定三氧治疗的真正疗效、最佳剂量和疗程.

创新盘点

随着医用三氧生物学与药理学特性的日趋明了, 医用三氧目前已应用于多种疾病的治疗, 然而预防性治疗作用报道较少, 仅国外有在器官缺血再灌注前应用三氧可以减轻器官损伤的报道. 本研究首次应用医用三氧及中药预防性治疗药物性肝炎, 并将二者疗效进行平行对比.

应用要点

本研究为医用三氧及中药护肝方在临床中对药物性肝损伤的预防应用提供了实验 依据. 医用三氧及中药护肝方有可能成为预防药物性肝炎的新方法. 其临床疗效有待在临床试验研究中证实.

同行评价

尽管药物性肝炎问题日益突出, 但迄今尚无预防药物性肝炎的有效方法. 医用三氧具有其特殊生物药理学特点. 本文应用中药护肝方及医用三氧对急性中毒性肝衰竭犬的预防性治疗作用. 文章有较好的科学性、创新性和可读性, 能较好地本领域基础研究的先进水平.

备注

电编:张敏 编辑:张焕兰

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