文献综述 Open Access
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世界华人消化杂志. 2007-09-28; 15(27): 2897-2902
在线出版日期: 2007-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v15.i27.2897
丙型肝炎基因型定量检测及分型检测方法的研究进展
王静, 王露楠
王静, 中国协和医科大学 北京市 100730
王露楠, 北京医院卫生部临床检验中心 北京市 100730
通讯作者: 王露楠, 100730, 北京市, 北京医院卫生部临床检验中心. lunan99@yahoo.com
电话: 010-58115053
收稿日期: 2007-05-31
修回日期: 2007-09-18
接受日期: 2007-09-28
在线出版日期: 2007-09-28

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是一种RNA病毒, 可以引发各种慢性肝病, 其中包括肝硬化和肝细胞癌. 全球每年HCV感染的患者数呈上升趋势, 他已成为人类亟待解决的公共卫生难题. HCV可以分为6种主要的基因型以及70多种亚型, 不同的基因型对抗病毒治疗的效果不同. 如果在治疗前能通过准确灵敏的检测手段确定HCV的基因型, 将会对临床治疗有重要的意义. 本文对HCV基因型全球分布、临床表症与治疗、分型依据以及基因型与定量关系进行了概述, 并重点阐述HCV基因分型的检测技术.

关键词: 丙型肝炎病毒; 基因型
引文著录: 王静, 王露楠. 丙型肝炎基因型定量检测及分型检测方法的研究进展. 世界华人消化杂志 2007; 15(27): 2897-2902
Research progress in hepatitis C virus quantity and genotyping assays
Jing Wang, Lu-Nan Wang
Jing Wang, Peking Union Medical College, Beijing 100730, China
Lu-Nan Wang, National Center for Clinical Laboratories, Beijing Hospital, Beijing 100730, China
Correspondence to: Lu-Nan Wang, National Center for Clinical Laboratories, Beijing Hospital, Beijing 100730, China. lunan99@yahoo.com
Received: May 31, 2007
Revised: September 18, 2007
Accepted: September 28, 2007
Published online: September 28, 2007

Hepatitis C virus is an RNA virus that can cause liver disease, including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Since cases of HCV infection have been increasing annually, HCV infection has become a global health problem. Six different genotypes of HCV and more than 70 subtypes have been identified, and patients infected with different HCV genotypes show different responses to antiviral therapy. Therefore, determination of the HCV genotype by accurate and sensitive methods will have a significant impact on clinical therapy. This review summarizes the information about hepatitis C genotyping and global distribution, its clinical symptoms and treatment methods, genotype evidence, the relationship between the genotype and quantity, and genotyping assays.

Key Words: Hepatitis C virus; Genotype
0 引言

HCV是单股正链RNA病毒, 全长9.6 kb. HCV病毒基因组由5'非编码区(5'UTR)、3'非编码区(3'UTR)、包膜区(E1和E2)、核心区(C)以及非结构区(NS2-NS5)组成. 其中包膜区和核心区编码病毒颗粒, 非结构区在病毒复制和病毒蛋白合成中起重要作用. HCV与瘟病毒和黄病毒的基因组结构相似, 与这些病毒同属于黄病毒族病毒.

由于HCV复制所依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能, HCV病毒常表现出高度的变异性. 不同的基因结构区变异的程度也不同[1-2]. 5'UTR是病毒基因组中最保守的区域, NS5A的高度可变区(the hypervariable regions, HVRs)和包膜区最不保守. HVRs的突变可引发免疫逃逸, 并与慢性感染的产生有十分重要的关系[2-3].

1 HCV基因型全球分布及流行病研究

不同地区的HCV基因型也有所不同. 毒品静脉注射者一般为1a型, 该类型一般在美国和欧洲很普遍. 1b型分布于世界各地是当前最主要的基因型[4]. 2a和2b型在北美、欧洲和日本比较普遍, 2c型在意大利北部地区较多. 3型分布于印度次大陆地区、东南亚以及印度尼西亚地区. 4型在北非和中东比较多, 南非和香港分别发现5型和6型[5]. 中国主要的基因亚型是1b型占66%, 其次是2a型占14%, 在广州和昆明地区还发现了少量的6型患者[6]. 总体来看1、2和3型分布广, 但是由于受到人口流动和毒品注射者增多的影响, 这种地区分布不是固定不变的.

HCV基因型的地区分布为流行病学研究提供了帮助[7]. 从基因型分布中我们可以跟踪到人群中HCV爆发的来源. 此外, 种系分析和群体遗传学的联合应用还能估算出不同基因型的存在时间和传播速率[8-9].

2 HCV基因型与临床表症及治疗的关系

感染了HCV的患者通常会引发各种严重的肝病, 例如肝硬化和肝细胞癌. 目前主要的治疗手段是用α干扰素或者与利巴韦林联合使用. 如果在治疗后期患者血清中的HCV RNA被清除并能维持6 mo, 就有持续病毒学应答(the sustained viral response, SVR), 说明治疗是有效的[10]. 抗病毒治疗的效果受到多方面因素的影响, 例如HCV基因型、病毒载量以及患者年龄、性别和肝纤维化的程度. 其中HCV基因型被认为在临床治疗方面影响最大. 大量的临床试验表明, 当利巴韦林和α干扰素联合治疗时, 1型患者的治疗效果没有2、3型的效果好[11]. 联合治疗24 wk后, 只有16%的1型患者对联合治疗有持续病毒学应答(SVR), 而2、3型能达到70%. 治疗48 wk后, 1型能提高到30%, 2、3型仍能保持70%左右. 4、5、6型以及各种HCV亚型的治疗效果没有1-3型的明显, 原因仍需进一步研究.

为什么对一些HCV基因型的治疗效果好, 而另一些治疗效果却不好, 目前还没有明确的理论依据. 丙肝病毒复制所依赖的无校正功能的RNA聚合酶可产生不同的HCV基因型. 各种HCV基因组序列不同, 所编码的蛋白质结构及功能也存在差异, 可能造成对α干扰素治疗敏感度的不同[12-13]. 有研究指出HCV基因组的某些区域及其编码蛋白质可能对α干扰素的治疗有抑制作用, 但是目前还没确定是哪个区域起作用, 仍需要进一步研究.

3 HCV基因分型的依据

自从1991年Choo et al发现丙型肝炎病毒并确定基因组后, 陆续有大量的HCV分离株被发现, 他们有不同的核酸序列. 确定这些病毒株的归属对于今后的研究工作有很大的帮助. HCV由多个区域组成, 选择哪个区域作为分型依据成为问题的关键. 5'UTR的序列保守, 种系变化程度以及进化率都很低[14], 用于区分HCV主要基因型. 但是, 1型和6型在5'UTR的序列相似, 需要通过其他的区域进行区分, 这一点对6型经常出现的东南亚国家应该引起重视[15]. 同时也有研究表明, 在5'UTR序列中会发生113或116 bp缺失, 缺失区域从126或129位到124位[16]. 该区域部分碱基的缺失对病毒复制和蛋白合成影响不大. NS5b区域的变异大, 可以很容易区分不同HCV病毒株, 常作为区分亚型的主要选择区域[14-15]. 1993年, Simmonds et al[1]选择NS5B作为分型区域, 利用核酸测序方法和种系分析最终确立HCV分为6种主要基因型以及70多种亚型, 这也是目前国际通用的HCV分型命名. 除此以外, 还有用两个以上的不同区域同时检测, 使分型的范围更广, 例如core与E1, 5'UTR与core[17-18].

4 HCV基因型与定量检测的关系

目前, 评价α干扰素或利巴韦林治疗丙型肝炎效果的主要依据是临床治疗前、中、后期HCV RNA病毒载量变化. 可靠的HCV定量方法对病毒监测与临床治疗起至关重要的作用. 常见的HCV定量仪器按检测原理可以分为4类: (1)竞争性定量PCR, 如Roche的Amplicor HCV Monitor和COBAS Amplicor HCV Monitor. (2)不依赖于PCR的信号放大检测系统, 如Bayer的bDNA. (3)以及real time PCR, 如Abbott的RT-PCR和Roche的RT-PCR. (4)依赖核酸序列的扩增NASBA[19].

竞争性定量PCR是逆转录和聚合酶链反应一步完成的检测HCV RNA的方法. 用已知拷贝数RNA作为内标物与患者样品用同一对引物(其中一个引物标记荧光)扩增, 两模板序列大致相同, 扩增效率也相同, 但扩增存在竞争性. 由于内标物与待测模板内切酶位点或部分序列不同, 扩增后PCR两种产物可通过限制性内切酶消化PCR产物或用不同的探针进行杂交而分开. Roche Monitor是国际公认的分子诊断金标准, 线性范围是从6×105 IU/L到8×108 IU/L[20]. 但是不同基因型检测的灵敏度不同, 2和3型的检测灵敏度分别只有1型的11%和8%[21]. Bayer的分枝DNA(bDNA)是信号放大方法, 利用大量捕获探针和带有大量报告分子的信号探针放大HCV RNA的信号. 该方法对HCV各种基因型的定量检测结果是可信的[22]. 但也有研究表明, bDNA 1代和2代检测系统对HCV 1-3型的结果不同[21]. bDNA-1与bDNA-2定量检测1型的效率相似(比率是1.04), 而定量检测2、3型的比率分别是0.22和0.46, 都低于预期值. bDNA的检测范围从6.15×105 IU/L到7.70×109 IU/L, 在线性范围内重复性很好, 是获得FDA批准的HCV RNA定量检测方法. Real time PCR定量检测HCV RNA有更宽的线性范围1×103 IU/L到1.07×105 IU/L, 以及完整的自动化检测系统. 他被认为是定量DNA或RNA灵敏度较高的检测手段. 但在检测不同基因型时也会有差异. 当检测HCV1-4型不同基因型时, Abbott的RT-PCR与bDNA检测1-3型的结果一致, 而Roche的RT-PCR与bDNA只有2个基因型(1型和2型)的检测结果一致. NASBA是90年代建立的一种核酸扩增技术, 最早用于HIV RNA定量检测. 与传统的PCR不同, NASBA是由一对引物引导的, 连续均一的体外特异核酸序列等温扩增的酶促反应. 他与bDNA的检测结果有很好的一致性, 并且敏感性比bDNA2.0还高出10倍. 当检测HCV1-5型以及1a和1b亚型时, 检测效率不同. 2型的检测效率最低, 1b型的最高, 两者的差别达到9.7%.

不论是同一种方法检测不同基因型, 还是不同方法检测同一基因型或亚型, 定量结果会出现不一致的情况. 像Real time RT-PCR的定量检测要经过复杂的过程, 核酸的提取、扩增和检测各环节都可能出现问题[23]. 引物或探针与模板的错配、区分不同型依赖的靶区域二级结构的差别都可能导致定量不准确. 两种不同原理的定量仪器检测同一基因型时结果不一致, 还有可能受到线性检测范围的影响. 因此, 在应用某种检测方法定量HCV RNA时, 要充分考虑到所选的检测方法以及不同基因型或亚型的影响.

5 早期基因分型技术

PCR限制性片段长度多态性方法(RFLP)和亚型特异PCR方法是较早出现的HCV基因分型检测方法. RFLP利用RT-PCR扩增具有不同酶切位点的各种HCV基因型, 再用3-5种不同的限制性内切酶消化PCR产物, 电泳结果与已知限制性片段数据库比较确定基因型. PCR-RFLP扩增的区域可以是5'UTR、核心区以及NS5B[24-26]. 扩增5'UTR的PCR-RFLP在检测HCV主要基因型时效果最好. 亚型特异PCR[27]其引物扩增HCV的NS5B或核心区, 扩增产物再进行电泳, 根据是否出现特异条带分析结果. 由于其扩增的是HCV种系信息区域, 在区分亚型方面比扩增5'UTR的方法准确, 同时又比测序的方法简单快速. 但是, 每种亚型只用一对引物扩增, 若基因组突变就无法检测. 由于检测准确性低、成本高等原因, 这两种方法并没有在临床实验室中得到广泛使用.

6 商品化分型技术

自线性探针反向杂交技术(LiPA)是临床实验室普遍使用的分型技术之一. 他是利用RT-PCR通过生物素标记的引物扩增HCV 5'UTR, 得到生物素标记的DNA. DNA变性后, 再与固定在纤维素膜上的基因型特异探针杂交, 同时加入碱性磷酸酶和显色剂, 通过LiPA条带放射自显影就能检测HCV基因型. 检测结果与金标准有很好的一致性. 早期的LiPA只扩增5'UTR, 不能区分1a和1b亚型、4型的亚型以及东南亚6型的变种[28-30]. 而目前新一代的LiPA(Bayer VERSANT HCV genotype 2.0)可以准确区分1型与东南亚6c-6l亚型, 并可以根据核心区的序列更准确的区分1a和1b型[18]. 该技术与之前基因分型检测结果比较其一致性很高, 是可以信赖的分型方法[31-32]. LiPA对HCV低载量患者的检测结果不好, Bayer公司的Comanor和他的同事开发了一种更敏感的转录介导扩增(TMA)-LiPA技术解决这个难题. 他把Bayer HCV TMA技术与LiPA技术联合使用[33]. 这种方法利用TMA反应中扩增RNA时产生的少量双链DNA副产物, 与生物素标记的引物退火延伸, 扩增产物再与LiPA条带杂交. TMA技术的高敏感性(5-10×103 IU/L)使低载量HCV病毒也能检测, 并且研究者还证明了TMA-LiPA与LiPA在检测基因型方面有很好的一致性.

近年出现的Invader HCV是一种荧光探针与内切酶联用的基因分型检测技术. 在1 h内便可检测HCV 1-6型在5'UTR的序列变异, 但不能区分亚型[34]. 由于是新技术, 相关的文献报道较少.

实时荧光PCR是根据荧光共振能量转移的原理检测基因型[35-36]. 检测探针多是Taqman探针, 也有MGB探针等, 检测结果与LiPA一致[37-39]. 目前多数检测技术扩增的都是保守的5'UTR. 虽然可以很好的区分HCV主要基因型, 但限制了亚型的检测. Abbott公司最新上市的Abbott HCV ASR是一种多色三管Real-time RT-PCR技术[40]. 他扩增5'UTR和NS5B 2个区域, 不但可以检测HCV主要的基因型, 还能区分1型中的1a和1b亚型.

上述三种商品化的分子生物学检测方法各有其优缺点. LiPA的检测成本最低, 但操作时间长, 会有鬼带出现的情况; Abbott HCV ASR操作时间短, 但检测成本高, 对4型的检测缺乏特异性; Invader HCV的操作时间和检测成本居于两者之间. 因此, 在检测HCV基因型时, 要充分考虑不同方法的特点后再选用某种方法检测.在血清学方法中Chiron公司的RIBA SIA检测NS4和核心区编码的抗原, 可用来区分1-3型[41]. Murex公司的Murex HCV利用基因型特异抗体直接检测NS4编码的抗原表位, 能区分1-6型[42]. 血清学技术污染低、方法简单, 适用于大样本量的流行病筛查.

7 其他扩增5'UTR的分型法

此外, 还有检测HCV混合基因型感染方面很突出的特异引物延伸分析法(PSEA)[43-44], 与金标准在基因型和亚型上的一致性分别达到96%和87%的变性高效液相色谱法[45], 能准确区别1-3型的单链构象多态性(SSCP)和低说服力单个特异引物(LSSP)-PCR[46], 质谱分析法等[47].

8 金标准

目前对于临床实验室来说只需检测出HCV主要基因型就能为临床治疗提供充足的信息. 但是, 若想进行流行病研究或亚型检测, 就不能用HCV 5'UTR的分型方法, 而要考虑其他的区域. 利用RT-PCR扩增HCV基因组种系信息区(NS5B、核心区或E1)并测序, 测序的结果再与已知基因型序列比较是HCV基因型检测的金标准[48-49]. Bayer的TRUGENE 5'NC HCV是已商品化的测序试剂, 有其专门的试剂盒、测序系统以及分析软件. 检测区域在5'UTR, 区分主要基因型与LiPA有很好的一致性[50-52], 但不能准确检测亚型. NS5B区域的检测试剂还没有上市, 只能作为TRUGENE 5'NC的内参照[53].测序检测的成本高, 需要专业人员的操作, 检测混合感染方面也不如其他方法好. 由于HCV种系信息区域的高度可变性, 引物的结合位点也可能发生变异, 引物不能与模板结合, 无法进行RT PCR和测序, 可最终导致实验失败.

9 结论

丙型肝炎及其并发症日益受到人们的关注. HCV基因型作为重要的流行病学指标, 对指导HCV临床治疗具有十分重要的意义. 早期的检测方法由于准确性和经费等问题, 并没有广泛的应用于临床实验室. 目前, 常见的是一些商品化的分型试剂盒. 分子生物学的试剂盒虽然检测原理各有不同, 但扩增的区域主要是5'UTR. 5'UTR具有高度保守性, 可以避免由于引物结合位点序列的突变而导致实验失败. 但是由于5'UTR不具有HCV其他区域的高度异质性, 扩增5'UTR的方法也只能检测HCV主要基因型, 在亚型方面的检测结果就差一些. 作为临床指导治疗的指标, 扩增5'UTR检测主要基因型就足够了. 血清学方法检测试剂主要用于大量流行病研究, 但其在特异性、灵敏度以及准确性方面没有分子生物学方法好. 检测HCV基因型的金标准是对NS5B、核心区或是E1区测序. NS5B、核心区以及E1区都是种系信息区, 异质性高, 能精确检测出亚型. 但是这些区域的序列存在很大差异, 有时无法顺利进行RT-PCR和测序. 最近几年, 又出现了一批新技术应用于HCV基因型检测, 对这些方法各项性能的研究刚刚起步, 今后还需要做更多的研究工作. 总之, 理想的临床检测HCV基因型的方法除了能准确区分基因型和亚型外, 还应具备实验成本低、易于操作并能检测低载量HCV RNA等特点.

评论
背景资料

丙型肝炎病毒是一种RNA病毒,能引发多种肝病. HCV根据序列间的差异可分为6种主要的基因型和一系列的亚型, 不同基因型其定量检验的结果不同, 同时对治疗的效果也不同.

相关报道

PCR限制性片段长度多态性方法(RFLP)和亚型特异PCR方法是较早出现的HCV基因分型检测方法, 但在实验室中并没有广泛应用, 目前相关的文献报道较少.

创新盘点

本文从HCV基因型的角度出发, 较全方面的介绍了 HCV基因型的全球分布、与治疗的关系、分型依据以及与定量检测的关系, 并概述了HCV基因分型所用的检测技术.

应用要点

同种方法对不同 HCV基因型做定量分析时, 结果可能存在偏差; 不同的方法对同一 HCV基因型定量时也可能产生偏差, 如何正确认识这种偏差对临床检验意义重大. 应用准确灵敏的方法在治疗之前有效的区分患者所属的基因型十分重要.

名词解释

持续病毒学应答: 简称SVR, 即停止治疗6 mo后病毒 RNA的阴性试验检测, 是判断治疗是否有效的标准.

同行评价

本文综述了HCV基因型的全球分布, 临床表现与治疗, 分型依据以及基因型与定量的关系, 内容全面, 层次清楚, 文笔流畅, 有一定的可读性和参考性.

编辑:程剑侠 电编:郭海丽

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