Smad7质粒转染对肝星形细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因表达的影响

摘要

目的: 研究上调Smad7表达对肝星形细胞(HSC)α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因转录的作用.

方法: 应用Fugene6介导Smad7质粒转染体外培养的HSC-T6细胞. 继续培养48 h. 同时使用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR), 逆转录酶链式反应(RT-PCR)方法检测Smad7质粒组和正常对照组、空载质粒对照组α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.

结果: 与正常对照组和空载质粒对照组相比, Smad7质粒转染HSC-T6细胞48 h后, Smad7 mRNA水平显著增高(1.29±0.18 vs 0.11±0.02, 0.13±0.02, 均P<0.01), α1(Ⅰ)前胶原mRNA表达明显下降(0.10±0.01 vs 1.18±0.15, 1.07±0.12, 均P<0.01), 但α1 (Ⅲ)前胶原基因表达无明显改变(0.72±0.00 vs 0.70±0.01, 0.75±0.01, 均P>0.05).

结论: Smad7能明显抑制HSC细胞α1(Ⅰ)前胶原mRNA转录.

关键词: Smad7; 肝星状细胞系; 细胞外基质; α1(I)前胶原; α1(Ⅲ)前胶原; 实时定量聚合酶链式反应

Upregulation of Smad7 in the expression of procollagen α1(Ⅰ) and α1(Ⅲ) genes in hepatic stellate cells

Yi-Hua Ruan, Hai-Lin Liu

Yi-Hua Ruan, Hai-Lin Liu, Department of Gastroenterology, the Ninth People's Hospital Affiliated to Medical College of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200011, China

Supported by: the Science and Technology Committee Foundation of Shanghai Municipality, No. 04JC14043.

Correspondence to: Hai-Lin Liu, Department of Gastroenterology, the Ninth People's Hospital Affiliated to Medical College of Shanghai Jiaotong University, 639 Zhizaoju Road, Shanghai 200011, China. liuhailin@medmail.com.cn

Received: April 16, 2007
Revised: August 17, 2007
Accepted: August 28, 2007
Published online: August 28, 2007

Abstract

AIM: To investigate the effects of Smad7 on expressions of procollagen α1 (Ⅰ) and α1 (Ⅲ) genes in a cultured hepatic stellate cell line (HSC-T6).

METHODS: Smad7 plasmid was transfected into the HSC-T6 cell line by Fugene6. After 48 hours, the levels of procollagen α1 (Ⅰ) and α1 (Ⅲ) mRNA were determined by real-time polymerase chain reaction and reverse transcriptase-polymerase chain reaction, respectively.

RESULTS: Compared with the normal control and empty plasmid control groups, the expression of Smad7 mRNA was significantly increased in the Smad7 plasmid group after 48 hours (1.29 ± 0.18 vs 0.11 ± 0.02, 0.13 ± 0.02, both P < 0.01), and the level of procollagen α1 (Ⅰ) mRNA declined markedly (0.10 ± 0.01 vs 1.18 ± 0.15, 1.07 ± 0.12, both P < 0.01). However, there was no statistically significant variation of procollagen α1 (Ⅲ) mRNA among the three groups (0.72 ± 0.00 vs 0.70 ± 0.01, 0.75 ± 0.01, both P > 0.05).

CONCLUSION: Smad7 may significantly inhibit the transcription of procollagen α1 (Ⅰ) mRNA. The mechanism may involve Smad7 antifibrosis.

Key Words: Smad7; HSC-T6 cell line; Extracellular matrix; Procollagen α1 (Ⅰ); Procollagen α1 (Ⅲ); Real-time polymerase chain reaction

0 引言

肝纤维化是由于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肝内过多沉积的结果. 肝星形细胞(HSC)在肝纤维化的发生、发展过程中起主导作用. 激活的HSC合成大量的ECM, 其中Ⅰ, Ⅲ型胶原为主要组成成分. Smad7能够通过抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)的信号转导, 发挥抗肝纤维化作用[1-3]. 虽然有研究表明Smad7抑制a1(Ⅰ)前胶原转录[4-5], 但大多采用RT-PCR方法, 定量的准确性不高. 有关Smad7对a1(Ⅲ)前胶原表达的作用, 少有报道. 本文应用Real time-PCR定量检测了Smad7对HSC-T6 a1(Ⅰ)和a1(Ⅲ)前胶原基因表达的影响, 探讨其作用环节.

1 材料和方法

1.1 材料

HSC-T6细胞由上海中医药大学肝病研究所提供; pcDNA3.0-人Smad7重组质粒和pcDNA3.0空载质粒由本院组织工程实验室惠赠; Fugene6转染试剂购自Roche公司; TRIzol试剂盒购自Gibco公司; 各目的基因引物由上海生工生物工程公司合成.

1.2 方法

将HSC-T6细胞接种于6孔培养板中, 细胞浓度为1×10⁸/L, 每孔2 mL. 37℃, 50 mL/L CO₂、饱和湿度培养24 h, 随机分为正常对照组、空载质粒对照组和Smad7质粒组, 每组4个复孔. 分别加入同体积的DMEM培养基、含2 mg pcDNA3.0空载质粒或pcDNA3.0-人Smad7重组质粒的Fugene6(Roche公司)转染液, 继续培养48 h, 收集细胞进行各项相关检测. 用TRIzol试剂盒提取HSC-T6细胞总RNA. 取总RNA 2 mg根据RT试剂盒使用说明书, 逆转录为cDNA. 然后, 在Mx3000P实时荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)上定量检测Smad7, a1(Ⅰ)前胶原和a1(Ⅲ)前胶原mRNA水平. 各目的基因引物序列如下. Smad7: 5'-CAACTGCAGACTGTCCAGATG-3'(上游), 5'-CTGCTGCATAAACTCGTGGTC-3'(下游); a1(Ⅰ)前胶原: 5'-CCAATCTGGTTCCCTCCC-3'(上游), 5'-AGGTTGAATGCACTTTTGG-3'(下游); a1(Ⅲ)前胶原: 5'-GTACAGCTGGCCTTCCTCAG-3'(上游), 5'-GGCCTTGCGTGTTTGATATT-3'(下游); 反应体系为: ddH2O 10.125 mL, cDNA 1 mL, 2×SYBR Green QPCR master mix 12.5 mL, ROX passive reference 0.375 mL, Forward primer (10 mmol/L) 0.5 mL, Reverse primer (10 mmol/L) 0.5 mL, 总体积25 mL. 每个样品设3个复孔, 并设置无模板对照. 各目的基因反应条件为: Smad7: 95℃预变性10 min, 95℃ 2 min, 60℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 共40个循环; a1(Ⅰ)前胶原: 95℃预变性10 min, 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40个循环; a1(Ⅲ)前胶原: 95℃预变性10 min, 94℃ 30 s, 55℃ 45 s, 72℃ 30 s, 共40个循环. 循环结束后继续进行建立熔解曲线的反应, 最后用专用软件自动分析结果. mRNA水平用相对含量图表示. 同时采用PCR测定各目的基因mRNA水平. 除Smad7和a1(Ⅲ)前胶原为28个循环, a1(Ⅰ)前胶原扩增30个循环外, 引物和其他反应条件同上. PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 天能凝胶分析系统图像分析. 计算目的基因条带灰度值, 与内参β-actin条带灰度值的比值, 作为该目的基因表达的相对值.

统计学处理 数值用mean±SD表示, 多组比较用方差分析, 两组间比较用t检验.

2 结果

2.1 Smad7质粒的转染

Real time-PCR结果显示, 与正常对照组和空载质粒对照组相比, Smad7质粒组Smad7 mRNA水平显著增高(P<0.01, 图1A); RT-PCR测定Smad7质粒组、正常对照组和空载质粒对照组Smad7 mRNA表达相对含量分别为: 1.29±0.18, 0.11±0.02和0.13±0.02, 与正常对照组和空载质粒对照组相比, 差异有统计学意义(P<0.01), 与Real time-PCR结果一致, 表明Smad7质粒在Fugene6介导下有效转染至HSC-T6细胞.

图1 Real time-PCR测定Smad7、α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平. A: Smad7; B: α1(Ⅰ); C: α1(Ⅲ). ^bP<0.01 vs 正常组.

2.2 a1(Ⅰ)前胶原和a1(Ⅲ)前胶原mRNA的表达

Real time-PCR检测Smad7质粒组a1(Ⅰ)前胶原mRNA水平较正常对照组和空载质粒对照组明显降低(P<0.01, 图1B), 但3组a1(Ⅲ)前胶原mRNA水平无显著差异(P>0.05, 图1C). RT-PCR测定Smad7质粒组、正常对照组和空载质粒对照组a1(Ⅰ)和a1(Ⅲ)前胶原mRNA表达相对含量与Real time-PCR结果一致[a1(Ⅰ): 0.10±0.01 vs 1.18±0.15, 1.07±0.12, 均P<0.01; a1(Ⅲ): 0.72±0.00 vs 0.70±0.01, 0.75±0.01, 均P>0.05].

3 讨论

Ⅰ型胶原由两条α1(Ⅰ)前胶原和一条α2(Ⅰ)前胶原组合而成; Ⅲ型胶原由3条α1(Ⅲ)前胶原组合而成. 肝纤维化时, 不仅总胶原含量显著增加, 而且各胶原成分的构成比与分布发生改变, 其中以Ⅰ型胶原增加为主, 使Ⅰ/Ⅲ型比例增高. TGF-β1能促进肝星形细胞活化, 使ECM合成增加, 降解减少, 是最主要的促肝纤维化细胞因子之一[6-8]. TGF-β1通过TGF-β1/Smads信号转导通路发挥作用. TGF-β1首先与其Ⅱ型受体结合, 活化的Ⅱ型受体蛋白激酶使Ⅰ型受体磷酸化, 活化的Ⅰ型受体蛋白激酶作用于Smad2, 3, 使其磷酸化, 随后Smad2, 3与4形成异源寡聚体复合物, 移入核内[9-13]. 在核内其与目的基因启动子区的Smads反应元件结合, 启动基因转录, 包括胶原基因、Smad7基因等[14].

活化的Smad2, 3和4形成的异源寡聚体复合物进入核内促进纤溶酶源激活物抑止因子-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)和Ⅶ型胶原的表达, 进而使ECM合成增加而降解减少[15-16]. HSC合成量最大的Ⅰ型胶原需要Smad3的作用, 在HSC内, Smad3, Sp1共同结合于a2(Ⅰ)胶原基因序列-313至-255位点, 该位点有很强的增强子活性, 结合Smad3, Sp1后胶原基因表达明显增加[17-20]. 有关TGF-β1对Ⅲ型胶原合成影响的分子机制尚不明了.

Smad7是TGF-β1/Smads信号转导通路中的主要抑制性调控蛋白, 通过与R-smads(Smad2, 3)竞争性结合TGF-β1受体Ⅰ(TbRⅠ), 抑制TGF-β1/Smads的信号转导; 另一方面Smad7还可与smurfl/2结合, 通过泛素化途径降解TβRⅠ, 对TGF-β1细胞内信号转导进行负反馈调节[21-23]. Dooley et al[4]应用携带Smad7的腺病毒转染原代培养的HSC后, HSC活化被抑制, a1(Ⅰ)前胶原mRNA水平降低. 对原代培养的HSC转染Smad7, 可显著抑制TGF-β1诱导的a1(Ⅰ)前胶原基因表达[5]. 本文采用Fugene6介导Smad7质粒转染HSC-T6细胞, 使Smad7过度表达, Real time-PCR和RT-PCR检测均表明a1(Ⅰ)前胶原mRNA水平显著下降, 提示抑制HSC a1(Ⅰ)前胶原基因转录可能是Smad7抗肝纤维化的作用机制之一.

关于Smad7对a1(Ⅲ)前胶原mRNA表达的作用, 目前尚未见报道. 最近, 有人应用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽引物与Smad7共同构建的重组质粒转染HSC, 测定细胞上清夜中Ⅲ型胶原蛋白含量减少. 但本结果显示上调Smad7基因表达对a1(Ⅲ)前胶原mRNA水平无明显影响. 推测这可能与RGD本身的作用有关. RGD三肽可以促进HSC胶原酶的表达, 从而使胶原的降解增加[24]. 同时, 还可拮抗TGF-β1对ECM分泌的促进作用[25]. 由于从基因转录到胶原合成分泌, 涉及转录后修饰、翻译、降解等多个环节, Smad7对a1(Ⅲ)型胶原生成的作用还有待进一步研究.

总之, 通过上调Smad7表达能够显著抑制HSC a1(Ⅰ)前胶原基因转录, 为今后用于肝纤维化防治提供了实验依据.

评论

背景资料

转化生长因子-β1能促进肝星形细胞活化, 使EC M合成增加, 降解减少, 是最主要的促肝纤维化细胞因子之一. Smad7能够通过抑制TGF-β1的信号转导, 发挥抗肝纤维化作用. 研究表明Sma d7 可抑制 a1(Ⅰ) 前胶原转录, 进而减少细胞外基质的合成, 而有关Sma d7 对Ⅲ型胶原合成影响的研究甚少.

研发前沿

Sma d7 抗肝纤维化的机制是目前防治肝纤维化研究中的热点. 研究表明Sma d7 可抑制α1(Ⅰ) 前胶原转录, 从而发挥其抗肝纤维化的作用, 有关Smad7对Ⅲ型胶原合成的影响还鲜见报道, 且TGF-b1对Ⅲ型胶原合成影响的分子机制尚不明了.

创新盘点

虽然有研究表明Smad7抑制α1(Ⅰ)前胶原转录, 但大多采用RT-PCR方法, 定量的准确性不高. 有关Smad7对α1(Ⅲ) 前胶原表达的作用, 少有报道. 本文应用Real time-PCR定量检测了Sma d7对HSC-T6 α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ) 前胶原基因表达的影响,探讨其作用环节.

应用要点

本文通过Sma d7质粒转染体外培养的HSC-T6细胞, 进而来研究Sma d7 表达的上调对HSC细胞 α1(Ⅰ) 前胶原以及α1(Ⅲ) 前胶原的影响, 发现上调Sma d7 表达能够显著抑制HSC α1(Ⅰ) 前胶原基因转录, 而上调Sma d7 基因表达对α1(Ⅲ) 前胶原 mRNA水平无明显影响, 为今后用于肝纤维化防治提供了实验依据.

名词解释

素化途径: 即素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是细胞内降解蛋白质的重要途径, 主要经细胞颗粒中的蛋白酶体降解泛素化的细胞内蛋白质, 与细胞多种生理功能调节密切相关.

同行评价

本文采用定量 PCR的方法对于转染Sma d7 质粒后的肝星状细胞 α1(Ⅰ) 前胶原以及α1(Ⅲ) 前胶原 mRNA的表达进行定量的研究, 有一定的新颖性, 所采用的技术较得当, 结果结论较可信, 有一定的可读性和学术价值.

备注

编辑:何燕 电编:张敏

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