腹腔液中CD44和整合素β1表达与胃癌腹膜转移的关系

摘要

目的: 探讨腹腔液中CD44和整合素β1 mRNA表达与胃癌腹膜转移的关系.

方法: 收集50例胃癌患者的腹腔液标本, 用RT-PCR法检测其中CD44和整合素β1 mRNA的表达, 同时行腹腔液细胞学(PLC)检查. 按病灶浸润深度、浆膜类型、PLC检查结果、腹膜转移情况和TNM分期分组, 比较不同组之间CD44和整合素β1 mRNA的表达水平.

结果: 腹腔液CD44 mRNA表达水平与浆膜类型(F = 4.59, P<0.05)、腹膜转移有关(t = 2.655, P<0.05), 与PLC检查(t = 3.126, P<0.01)和TNM分期密切相关(t = 3.453, P<0.01); 腹膜转移组的整合素β1 mRNA表达明显高于未转移组的水平(t = 2.241, P<0.05).

结论: 腹腔液中CD44和整合素β1 mRNA表达与胃癌腹膜转移相关因素及TNM分期密切相关, 检测其水平有助于估计胃癌病程进展和患者预后, 对腹膜转移的早期诊断也有一定价值.

关键词: 胃肿瘤; 腹膜种植性转移; CD44; 整合素β1

Expression of CD44 and integrin β1 in peritoneal lavage fluid and their correlations with the peritoneal metastasis of gastric cancer

Dong-Hui Zhao, Hui-Mian Xu, Xiu-Ju Sun, Shi-Pu Zhang

Dong-Hui Zhao, Hui-Mian Xu, Department of Oncological Surgery, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Xiu-Ju Sun, Department of Medical Genetics, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Shi-Pu Zhang, Department of General Surgery, Shenzhou Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110002, Liaoning Province, China

Supported by: the Science and Technology Project of Liaoning Province, No. 2005225005, and the Research Foundation of Shenyang Medical College, No. 20061004.

Correspondence to: Hui-Mian Xu, Department of Oncological Surgery, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. huimianxu@163.com

Received: January 15, 2007
Revised: February 1, 2007
Accepted: February 8, 2007
Published online: April 18, 2007

Abstract

AIM: To investigate the expression of CD44 and integrin β1 mRNA in peritoneal lavage fluid and their correlations with the peritoneal metastasis of gastric cancer.

METHODS: The samples of peritoneal lavage fluid were collected during operation from 50 patients with gastric cancer. The expression of CD44 and integrin β1 was detected at mRNA level by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and the examination of peritoneal lavage cytology (PLC) was also performed. All the cases were divided into different groups according to the invasion depth of foci, serosal types, results of PLC, peritoneal metastasis and TNM stages. Then the expression of CD44 and integrin β1 mRNA was compared among various groups.

RESULTS: The expression of CD44 mRNA was closely related to serosal types (F = 4.59, P < 0.05), peritoneal metastasis (t = 2.655, P < 0.05), results of PLC (t = 3.126, P < 0.01) and TNM stages (t = 3.453, P < 0.01). Integrin β1 mRNA expression was significantly higher in patients with peritoneal metastasis than that without metastasis (t = 2.241, P < 0.05).

CONCLUSION: The expression of CD44 and integrin β1 mRNA in peritoneal lavage fluid is related to the peritoneal metastasis-related factors and TNM stages of gastric cancer, detection of their levels is helpful to evaluate the progression, prognosis and early diagnosis of gastric cancer.

Key Words: Stomach neoplasm; Peritoneal metastasis; CD44; Integrin β1

0 引言

胃癌术后腹膜转移是影响患者长期生存的重要因素之一. 目前认为, 黏附分子CD44和整合素β1在腹膜转移的早期阶段发挥了重要作用[1]. 我们采用逆转录聚合酶链式反应, 即RT-PCR法检测胃癌患者腹腔液中CD44和整合素β1 mRNA的表达, 旨在探讨其表达水平与胃癌腹膜转移和病程进展的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2004-08/2005-01中国医科大学第一临床学院肿瘤外科50例胃癌手术患者的腹腔液. 根据病灶浸润深度、浆膜类型[2]、腹腔液细胞学(peritoneal lavage cytology, PLC)检查结果、有无肉眼腹膜转移及TNM分期进行分组. 细胞总RNA提取试剂TRIzol Reagent(Gibco BRL公司), 逆转录试剂盒Reverse Transcription System A3500、Taq DNA合成酶、PCR反应缓冲液(Promega公司), CD44、整合素β1及内对照β-actin的PCR引物(上海生工生物工程有限公司).

1.2 方法

1.2.1 腹腔液收集和PLC检查: 手术中开腹后, 于直肠-膀胱凹陷(女性为直肠-子宫凹陷, 即Douglas腔)置入一根导尿管, 注入无菌生理盐水100 mL, 轻轻搅拌后抽出; 如有自然腹水则直接抽取, 混血标本弃用. 将腹腔液送中国医科大学第一临床学院细胞病理室, 以2000 r/min离心10 min, 取少许沉渣涂片, 行巴氏(Papanicolaou)染色, 在显微镜下行PLC检查. 结果由两名病理学专家共同判定. 其余沉渣于-80 ℃冰箱中保存.

1.2.2 细胞总RNA提取: 取出保存的沉渣, 按照TRIzol试剂说明书进行细胞总RNA提取. 将提取的RNA溶于10 μL的无RNA酶水中, 于-80 ℃冰箱保存.

1.2.3 RT-PCR检测: 取1 μL RNA溶解液, 参照逆转录试剂盒说明书的比例加样, 进行逆转录反应. 反应条件为: 42 ℃, 60 min; 99 ℃, 5 min; 4 ℃, 5 min. 以cDNA为模板进行RCR扩增. CD44引物序列: 5'-GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC-3'和5'-GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAA-3', 产物片段482 bp; 整合素β1引物序列: 5'-GTGGAGAATGTATACAAGCAGG-3'和5'-CTAATGTAAGGCATCACAGTC-3', 产物片段486 bp; 内对照β-actin引物序列5'-TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3'和5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3', 产物片段320 bp. CD44 PCR反应条件: 变性: 95 ℃, 1 min; 退火: 55 ℃, 1 min; 延伸: 72 ℃, 1 min; 共30个循环; 整合素β1 PCR反应条件: 变性: 95 ℃, 45 s; 退火: 57 ℃, 45 s; 延伸: 72 ℃, 1 min; 共30个循环. 取PCR产物10 μL行15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 以GDS8000自动成像仪摄下电泳图像; 采用Gel-work-ID软件, 分析图像, 计算目的基因表达的相对定量值.

统计学处理 不同浸润深度、浆膜类型间的比较用方差分析, PLC是否阳性、有无腹膜转移及不同TNM分期间的比较用t检验.

2 结果

2.1 CD44和整合素β1 mRNA表达水平与腹膜转移及其相关因素的关系

CD44 mRNA表达水平与浆膜类型和腹膜转移有关, 与PLC结果密切相关; 整合素β1 mRNA表达水平与腹膜转移有关(图1, 表1).

表1 CD44和整合素β1 mRNA表达与腹膜转移及其相关因素的关系(mean±SD).

项目	n	CD44	整合素β1
浸润深度
黏膜+黏膜下	5	0.702±0.077	0.680±0.124
肌层+浆膜下	31	0.793±0.265	0.682±0.122
穿透浆膜	14	0.869±0.246	0.778±0.149
浆膜类型
正常+反应型	9	0.623±0.111a	0.648±0.130
结节型	14	0.737±0.217	0.688±0.138
腱状+多彩型	27	0.901±0.255	0.740±0.144
PLC检查
阴性	31	0.726±0.189d	0.679±0.132
阳性	19	0.934±0.282	0.757±0.151
腹膜转移
阴性	38	0.756±0.247e	0.686±0.125e
阳性	12	0.961±0.179	0.781±0.138

^aP<0.05 vs 结节型、腱状+多彩型;

^dP<0.01 vs PLC检查阳性;

^eP<0.05 vs 腹膜转移阳性.

图1 CD44和整合素β1 mRNA RT-PCR电泳图. A: CD44; B: 整合素β1; 最左侧为DNA Marker.

2.2 CD44和整合素β1 mRNA表达水平与胃癌TNM分期的关系

TNMⅢ+Ⅳ期病例腹腔液中CD44 mRNA表达水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期病例的水平. 整合素β1 mRNA表达水平在两组间无统计学差异(表2).

表2 CD44和整合素β1 mRNA表达与胃癌TNM分期的关系(mean±SD).

TNM分期	n	CD44	整合素β1
Ⅰ+Ⅱ期	19	0.667±0.129b	0.666±0.117
Ⅲ+Ⅳ期	31	0.890±0.262	0.735±0.141

^bP<0.01 vs Ⅲ+Ⅳ期.

3 讨论

腹膜转移是进展期胃癌术后最常见的复发形式, 其发生是一系列复杂过程的综合结果, 涉及黏附、降解、移动、血管生成、免疫逃避等多方面机制. 在转移发生的初始阶段, CD44和整合素β1介导的黏附过程发挥了重要作用[1,3-4].

人类CD44基因位于第11号染色体短臂, 其编码的黏附分子CD44是一种分布极为广泛的细胞表面透明质酸受体. 许多学者认为, CD44基因和蛋白的异常表达与肿瘤的侵袭、转移行为密切相关, 并可能是癌细胞获得浸润、转移能力的决定因素之一[5]. CD44除了参与黏附过程外, 还可通过促进肿瘤细胞释放蛋白水解酶, 协助其逃避人体的免疫监视, 加速细胞迁移速率等机制促进转移[3,6]. 体外实验证实, CD44在腹膜转移进程中发挥着重要的促进作用[7-8], 通过转染反义寡核苷酸或基因敲除等方式处理肿瘤细胞, 可以明显地抑制其增生、转移潜能[9-10]. 本研究显示, 腹腔液中CD44 mRNA的表达在PLC检查阳性组明显高于阴性组(P<0.01), 并与浆膜类型和腹膜转移等因素有关(P<0.05), 提示CD44 mRNA表达水平与腹膜转移及其相关因素之间存在着密切联系; 随着腹膜转移的进展, 腹腔液中CD44 mRNA的表达水平逐渐增高.

整合素β1是整合素家族的主要亚基, 在许多肿瘤细胞系和人类实体肿瘤中出现高表达, 并与肿瘤的浸润性、低分化趋向和转移等恶性表型密切相关[11-12]. 和CD44一样, 整合素β1能够增强肿瘤细胞对间皮细胞和细胞外基质的黏附能力, 还能促进肿瘤细胞对蛋白水解酶的释放和活化, 促进肿瘤血管生成, 并加速肿瘤细胞迁移[13-15]. 本研究中, 腹腔液整合素β1 mRNA表达水平与腹膜转移有关(P<0.05); 此外, 随着病灶浸润的加深、浆膜受侵的加重和PLC阳性结果的出现, 其表达水平也有升高趋势, 但是没有统计学意义. 由此, 我们认为, 腹腔液中整合素β1 mRNA的表达与胃癌腹膜转移进程有关, 也是促进腹膜转移发生的重要因素之一. 但与CD44 mRNA相比, 整合素β1 mRNA的表达仅在形成肉眼腹膜转移后才表现出与无转移组之间的差异; 这表明, 在腹膜转移进程中, 整合素β1可能比CD44更迟发挥作用.

在腹膜转移的早期诊断方面, PLC检查目前被公认为最重要的手段, 但是由于细胞学诊断本身的复杂性和结果判定时难以避免的主观性, 其正确诊断率存在着较大波动, 一般仅为40%-60%. 近来的研究将免疫细胞化学检查与之结合起来, 提高了诊断的特异性. 应用新兴的生物学技术, 在分子水平对腹膜转移进行预测和早期诊断, 也是该领域的发展趋势之一. 已有学者发现, 腹腔液中CEA mRNA的表达是诊断、预测胃癌腹膜转移的一个良好指标[7,16]. 本研究中, CD44和整合素β1 mRNA在所有腹腔液中均有表达, 因此, 其单纯定性检测不能用于腹膜转移的诊断; 主要原因在于, CD44和整合素β1在腹腔液其他细胞成分中也有广泛表达, 不象CEA那样, 在肿瘤细胞中的表达比较特异. 然而, 如前所述, PLC阳性组的CD44 mRNA表达水平明显高于阴性组的水平; 这表明, 用定量方法检测腹腔液中的CD44 mRNA表达可能成为传统PLC检查的一个有益补充, 对胃癌腹膜转移的早期诊断和预测具有重要意义.

我们还发现, 随着胃癌TNM分期的进展, 腹腔液中CD44和整合素β1 mRNA的表达均呈上升趋势; TNMⅢ+Ⅳ期病例的CD44 mRNA表达水平高于Ⅰ+Ⅱ期的水平(P<0.01). 这一结果提示, 腹腔液中CD44 mRNA的表达水平在一定程度上反映了胃癌的病程进展, 并可以作为估计胃癌预后的一个重要指标.

评论

背景资料

腹膜转移是胃癌术后患者最常见的复发形式, 是影响患者预后的重要因素之一. 研究腹膜转移的过程、机制, 探寻其早期诊断和治疗方法, 对改善胃癌的治疗效果具有重要的理论和实践意义.

研发前沿

对黏附分子、蛋白水解酶、肿瘤转移相关基因等在腹膜转移发生、发展过程中作用的研究, 已经成为目前学界的热点, 但多数研究以细胞株为对象, 与临床实际情况尚有距离.

相关报道

徐惠绵、王夫景et al检测了胃癌患者腹腔液中CEAmRNA的表达, 发现腹腔液CEA检测较传统的细胞学检查更加敏感, 对腹膜转移的预测和早期发现具有重要意义, 从而为此方面研究提供了新的手段和思路.

创新盘点

本文将RT-PCR等先进研究手段应用于临床标本的检测, 使结论更接近临床实际, 具有明显的可操作性和实践意义.

名词解释

浆膜类型: 张文范et al提出, 根据胃癌浆膜的大体形态不同, 将其分为正常型、反应型、结节型、腱状型和多彩弥漫型, 各类型由轻到重, 反映了胃癌病灶侵袭浆膜的程度.

同行评价

本文研究了腹腔中CD44和整合素β1表达与胃癌腹膜转移的关系, 在胃癌腹膜转移方面的研究具有一定的科学性和可读性, 进一步充实了该领域的研究.

备注

编辑:张焕兰 电编:何基才

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